Banca de DEFESA: Izadora Cristina Moreira de Oliveira

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Izadora Cristina Moreira de Oliveira
DATA : 30/01/2023
HORA: 14:00
LOCAL: Auditório 4
TÍTULO:

ANÁLISE BIOQUÍMICA E ESTRUTURAL DE UMA ENDOXILANASE RECOMBINANTE DE Humicola grisea var. thermoidea EM COMPLEXO COM ÁCIDO FERÚLICO

PALAVRAS-CHAVES:

endoxilanase, ácido ferúlico, caracterização estrutural, enzimologia, estrutura de proteína, docking molecular

PÁGINAS: 186
RESUMO:

Uma endo-1,4-beta-xilanase de Humicola grisea var. thermoidea pertencente à família GH11 foi obtida por expressão em Pichia pastoris e denominada HXYN2. Esta enzima apresenta 227 aminoácidos e massa molecular de 23 kDa e é termicamente estável, com maior atividade na faixa de 40-50 °C e pH 5,0-9,0, e temperatura e pH ótimos de 50 °C e 6,0, respectivamente. Nesta faixa de pH a HXYN2 apresenta estrutura estável com leves mudanças conformacionais, indicadas pelos espectros de emissão de fluorescência com leve deslocamento das bandas de emissão, consistentes com resíduos de triptofano expostos ao solvente, e alterações nas cadeias laterais dos resíduos de triptofano e/ou de resíduos de aminoácidos que estão no microambiente do triptofano. Os espectros de dicroísmo circular (DC) da enzima em pH 4,0, 6,0, 7,0 e 9,0 apresentaram bandas típicas em comprimentos de onda que correspondem a proteínas com estruturas do tipo folhas beta. As curvas de desnaturação térmica obtidas em pH 6,0, 7,0 e 9,0 mostraram dois estados da proteína, nativa e desdobrada, com temperatura de transição (do inglês melting temperature - Tm) entre 50 e 60 °C. Em pH 4,0, esse ponto foi identificado entre 65 e 70 °C, o que sugere que HXYN2 é mais estável estruturalmente em pH ácido. A atividade da HXYN2 foi aumentada em 75% na presença do composto fenólico ácido ferúlico (AF), sem alterar sua afinidade pelo substrato de xilana beechwood. No entanto, o AF aumentou a Vmax, a eficiência catalítica e o número de turnover da enzima. Dados de ITC, atenuação de fluorescência e docking molecular mostraram que o AF forma um complexo com a HXYN2 na região aglicona, interagindo com resíduos de triptofano expostos ao solvente e outros resíduos nesta vizinhança, por meio de ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas. Os valores das constantes de ligação para o complexo HXYN2:AF são dependentes do pH e indicaram afinidade de moderada (em pH 7,0 e 9,0) a forte (em pH 4,0). Na presença de AF, os espectros de fluorescência de HXYN2 mostraram mudanças na posição e intensidade das bandas de emissão dependentes do pH. A estrutura secundária de HXYN2 na presença de AF foi alterada com diminuição da α-hélice e aumento de β-turn e estruturas desordenadas. A curva de desnaturação térmica na presença do AF apresentou Tm de 54 °C, indicando menor estabilidade estrutural da HXYN2 na presença deste composto. Os cristais da HXYN2 foram obtidos em diferentes condições de cristalização na etapa de triagem. O refinamento destas condições resultou em cristais de diferentes formas e dimensões. Dois destes cristais foram levados ao Laboratório Nacional de Luz Síncroton – Sirius para coleta de dados de difração de raios X. Os dados de difração foram processados, indicando que o grupo espacial P212121 (ortorrômbico) e a presença de um dímero na unidade assimétrica. A estrutura cristalográfica da HXYN2 foi obtida por substituição molecular utilizando como modelo as coordenadas da estrutura da endoxilanase de Thermomyces lanuginosus (PDB 1YNA).

MEMBROS DA BANCA:
Externo à Instituição - IVO DE ALMEIDA MARQUES - UFG
Interna - 2222088 - ELIANE FERREIRA NORONHA
Externa à Instituição - ERICA CRISTINA MORENO NASCIMENTO - UnB
Interna - 1207115 - ILDINETE SILVA PEREIRA
Presidente - 1122620 - SONIA MARIA DE FREITAS