Expandindo o estudo genético de Fonsecaea pedrosoi: O uso de marcadores e transformação biobalística para inativação do gene de triptofano sintase (trpB)
recombinação gênica homóloga; double-joint PCR; biolística; mutante; trpB; Biossíntese de triptofano; Fonsecaea; cromoblastomicose
A cromoblastomicose (CBM) é uma doença causada por vários fungos demáceos de diferentes gêneros, sendo o Fonsecaea o isolado clínico mais comum. Diversos métodos de transformação genética foram descritos recentemente; no entanto, ferramentas moleculares para o estudo funcional de genes têm sido pouco relatadas para esses fungos. Neste trabalho, demonstramos que a deleção do gene e a geração do mutante nulo por recombinação homóloga são possíveis para Fonsecaea pedrosoi pelo uso de duas abordagens: uso de PCR de dupla articulação para construção de cassete, seguido pela entrega do marcador dividido por biolística transformação. Por meio de análises in silico, identificamos que F. pedrosoi apresenta o aparato enzimático completo necessário para a biossíntese do triptofano (trp). O gene que codifica uma triptofano sintase trpB - que converte corismato em trp - foi interrompido. O mutante auxotrófico ΔtrpB pode crescer com suprimento externo de trp, mas a germinação, a viabilidade dos conídios e o crescimento radial são defeituosos em comparação com as cepas selvagens e reconstituídas. O uso de 5-FAA para seleção de trpfenótipos e para contra-seleção de cepas portadoras do gene trp também foi demonstrado. As ferramentas moleculares para o estudo funcional dos genes, aliadas às informações genéticas dos bancos de dados genômicos, aumentam significativamente nosso entendimento da biologia e da patogenicidade dos agentes causadores da CBM.