Banca de DEFESA: Thais Torquato Sales

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Thais Torquato Sales
DATA : 19/12/2024
HORA: 14:00
LOCAL: Meio virtual
TÍTULO:

“CONSTRUÇÃO DE INTERRUPTORES GENÉTICOS BASEADOS EM SERINA INTEGRASES PARA CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS”.

PALAVRAS-CHAVES:

bacteriófago, serina recombinases, circuito genético, interruptores genéticos, recombinação sítio-específica.

PÁGINAS: 48
RESUMO:

Resumo em português: As serina integrases são proteínas de bacteriófagos responsáveis pela integração do DNA viral no genoma bacteriano. Essa inserção ocorre por meio de uma sequência denominada attP (phago attachment site), com o DNA bacteriano em um sítio denominado attB (bacterial attachment site). Após a recombinação mediada pela integrase, o DNA viral é incorporado ao genoma da bactéria, os sítios são mesclados, e os novos sítios attL (left attachment site) e attR (right attachement site) são formados. Quando os sítios attB e attP são posicionados em sentidos opostos flanqueando uma sequência gênica de interesse, os sítios reconhecidos pela serina integrase faz uma inversão da sequência, ou seja, realiza um giro de 180° no DNA que se encontra entre os dois sítios, resultando na posição reverso complementar à inicial. Diversas serina integrases já foram utilizadas para controlar um gene repórter em células procarióticas. No entanto, a utilização de integrases em células eucarióticas como ferramenta para regulação da expressão gênica ainda é limitada. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a funcionalidade de seis integrases no controle da expressão gênica em células de mamíferos, visando a construção de um interruptor genético. Células de fibroblastos de pele bovina foram transfectadas com as seis integrases (Int2, Int4, Int5, Int7, Int9 e Int13) em um sistema de cotransfecção plasmidial, como segue: um vetor de expressão da integrase nomeado como pIE e um segundo vetor contendo a sequência codificadora (CDS) do gene repórter gfp em orientação reverso complementar, flanqueado pelos sítios attB/attP da respectiva integrase, intitulado pSG. Após a cotransfecção, as células foram incubadas durante 48 h e acúmulo de GFP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência e mensurada por citometria de fluxo. A inversão da CDS foi amplificada por meio da PCR e confirmada por sequenciamento do tipo Sanger. A florescência da GFP foi detectada por microscopia e citometria para Int9 e Int13. além disso, o sequenciamento evidenciou a correta inversão do gfp e a formação dos sítios attL/attR previstos para todas as integrases avaliadas.

MEMBROS DA BANCA:
Externa à Instituição - DANIELLE BISCARO PEDROLLI - UNESP
Presidente - ***.402.491-** - ELIBIO LEOPOLDO RECH FILHO - EMBRAPA - AC
Externa à Instituição - GRACIA MARIA SOARES ROSINHA - EMBRAPA
Interno - 2122537 - MARCELO DE MACEDO BRIGIDO
Externo ao Programa - 3301340 - NICOLAU BRITO DA CUNHA - null