Banca de DEFESA: Tatiana Shiroma Borges Ferreira

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Tatiana Shiroma Borges Ferreira
DATA : 24/03/2023
HORA: 14:00
LOCAL: Plataforma Teams
TÍTULO:

Uso de metodologia CRISPR/dCas9 para identificação de transferência gênica horizontal entre parasito e hospedeiro – aplicação na infecção por Trypanosoma cruzi

PALAVRAS-CHAVES:

Transferência gênica horizontal; CRISPR/dCas9; Trypanosoma cruzi; minicírculos de kDNA.

PÁGINAS: 10
RESUMO:

A transferência horizontal de genes (THG) tem um papel importante na plasticidade evolutiva dos organismos para novos ambientes e condições, podendo ser favorecida por diversas relações ecológicas, como o parasitismo. Exemplos convincentes de THG têm sido demonstrados em diferentes parasitos e hospedeiros, como é o caso do Trypanosoma cruzi. Várias metodologias são utilizadas para inferir a presença de THG entre organismos não relacionados, cada uma com seu próprio conjunto de características e limitações. Recentemente, técnicas de marcação fluorescente passaram a ser empregadas para verificar a integração e localização de genes candidatos a THG no genoma do hospedeiro. A esse respeito, vários estudos já utilizaram o sistema CRISPR/dCas9 (Cas9 desativada), ligado a GFP, para investigar a organização cromossômica e visualizar a dinâmica cromossômica e loci genômica. Embora nenhum estudo ainda tenha utilizado a técnica para detectar eventos THG, o sistema mostra-se promissor para tal, uma vez que possibilita avaliar a organização espaço-temporal dessas sequências no genoma. Neste trabalho, demonstramos a transferência gênica lateral na relação parasito-hospedeiro por metodologia CRISPR/dCas9, utilizando como modelo células infectadas pelo T. cruzi. Inicialmente, a técnica foi validada com diversos controles, o que mostrou especificidade de marcação e ausência de alvos inespecíficos. Em seguida, células HEK293 infectadas pelo parasito foram transfectadas com RNA guia (RNAg) para minicírculo de kDNA de T. cruzi após diferentes períodos de infecção. Observou-se marcação de sequências de kDNA em todos os períodos analisados. Ainda, visando demonstrar que a transferência de kDNA independe da presença do parasito, as células foram tratadas com benznidazol e analisadas após 30 dias do início da infecção. Em outro grupo experimental, as células foram colocadas em co-cultivo com o parasito utilizando sistemas transwell. Em ambas as situações, o sistema CRISPR/dCas9 demonstrou presença de minicírculo de kDNA de T. cruzi no genoma celular. A análise das amostras por PCR em tempo real (qPCR), confirmou a ausência de DNA nuclear do parasito e presença de kDNA. Os resultados obtidos demonstram que o sistema CRISPR/dCas9 foi capaz de identificar sequência de DNA proveniente de evento THG no modelo de estudo. Os achados suportam o uso da técnica como metodologia complementar na identificação e estudo de sequências transferidas horizontalmente entre diferentes organismos.

MEMBROS DA BANCA:
Interno - 1705802 - JOSE RAIMUNDO CORREA
Externa ao Programa - 2794682 - LUCIANA HAGSTROM BEX
Externa à Instituição - MARIA CAROLINA CAMBRAIA GUIMARO DINIZ - UMBC
Presidente - 2637419 - MARIANA MACHADO HECHT