Banca de DEFESA: MARIANGELA SOUZA DE OLIVEIRA

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : MARIANGELA SOUZA DE OLIVEIRA
DATA : 29/09/2023
HORA: 14:30
LOCAL: Plataforma Teams
TÍTULO:

Efeito do atazanavir, da curcumina e do lopinanir nas vias canônica e não canônica do NF-kB determinantes de resposta inflamatória em neuroblastomas SK e em células mononucleares do sangue periférico de mulheres gestantes incubadas in vitro com o vírus Zika.

PALAVRAS-CHAVES:

Vírus Zika, atazanavir, curcumina, lopinvir, NF-B, via canônica, via não canônica, microcefalia, gestante, neuroblastoma, citocinas

PÁGINAS: 223
RESUMO:

INTRODUÇÃO: O vírus Zika é um flavivírus transmitido por mosquitos que pode causar infecção congênita, microcefalia e síndrome de Guillain-Barré em humanos. O fator de transcrição nuclear NF-κB é um regulador chave da inflamação, da sobrevivência celular e da resposta imune, que pode ser ativado por diferentes vias canônicas e não canônicas. Alguns compostos naturais ou sintéticos, como o atazanavir, a curcumina e o lopinavir têm demonstrado efeitos moduladores sobre a via do NF-κB, podendo interferir na progressão da resposta imunológica das células mononucleares do sangue periférico de gestantes e de células de neuroblastoma. O atazanavir e o lopinavir são antivirais que inibem a protease do HIV e a curcumina é um pigmento extraído do açafrão-da-terra, que tem propriedades anti-inflamatórias, sendo capaz de inibir a ativação do NF-κB em vários tipos de células. Esses compostos podem representar potenciais agentes terapêuticos para doenças relacionadas ao NF-κB e em infecções como pelo vírus Zika. OBJETIVOS: O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito dos compostos atazanavir, curcumina e lopinavir nas vias canônica (que controla a resposta inflamatória) e não canônica de ativação do NF-kB, em células de neuroblastoma e células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de mulheres gestantes e não gestantes, incubadas in vitro com o vírus Zika. MATERIAIS E MÉTODOS: O estudo investigou por citometria de fluxo os efeitos da incubação in vitro com o vírus Zika e do tratamento in vitro com as drogas atazanavir, curcumina e lopinavir na expressão dos receptores para o TNF (rLTX, r1TNF e r2TNF) e das moléculas envolvidas na via do NFkB em células de neuroblastoma SKnBe e células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de mulheres controles normais e mulheres gestantes. A produção de citocinas inflamatórias e imunológicas foi quantificada por citometria de fluxo. Os seguintes grupos de estudos foram avaliados nos neuroblastomas e nas CMSP: 1) Controle (Cont), 2) incubados com o vírus Zika (ZKV), 3) tratados com atazanavir (Ataz), 4) tratados com atazanavir e incubados com o vírus Zika (Ataz+ZKV), 5) tratados com curcumina (Curc), 6) tratados com curcumina e incubados com o vírus Zika (Curc+ZKV), 7) tratados com lopinavir (Lopi) e 8) tratados com lopinavir e incubados com o vírus Zika (Lopi+ZKV). Para avaliação da cinética das citocinas os seguintes grupos de estudo foram formados: 1) Zika, 2) atazanavir+Zika, 3) curcumina+Zika e 4) lopinavir+Zika. A adsorção do vírus Zika foi feito após 30 min de incubação das placas contendo as células e os tratamentos iniciaram após 1 h de adsorção do vírus, permanecendo em tratamento por 6 horas. O grupo de gestantes estudadas eram normais com o índice de massa corporal (IMC) das voluntárias e os exames pré-natais das gestantes dentro da normalidade. Foram avaliados por citometria de fluxo, os receptores para linfotoxina (rLTXβ) e receptores para o TNF (r1TNF e r2TNF), as moléculas FADD, TRAF, NIK, JNK, IkB, P50, P52, P65 relA, relB e c-Rel nas células do neuroblastoma e na CMSP, e as citocinas Imunes: FNT, IFN-γ, IL-12p70, IL-2, IL-10, IL-4, IL-17A, as inflamatórias: IL-8, IL-1, IL, IL-10, FNT, IL-12p70 nos sobrenadantes das culturas dos neuroblastomas e CMSP e as quimiocinas: CXCL8/IL-8, RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1, CXCL10/IP-10 nos sobrenadantes das culturas das CMSP. Os resultados foram analisados pelos testes de ANOVA ou KruskalWallis, ANOVA para medidas repetidas ou Teste de Friedamn, teste t ou Mann-Whitney, segundo as indicações e considerado significante para p<0,05. RESULTADOS: Por microscopia eletrônica observamos a presença das partículas do vírus Zika no citoplasma dos neuroblastomas. Observamos inibição do crescimento do vírus Zika pelo tratamento com o atazanavir no período de 6 a 24 horas após a incubação. Com o tratamento com a curcumina houve redução do crescimento do vírus nas primeiras 6 horas após a incubação e com o lopinavir houve redução do crescimento entre os primeiros períodos após a infecção. Nossos resultados mostraram que os neuroblastomas apresentaram constitutivamente o rLTXβ, já mostrando maior expressão do receptor no grupo controle. Nos grupos incubados apenas com o vírus Zika, e os grupos atazanavir+zika, curcumina, curcumina+zika, lopinavir e lopinavir+zika houve maior expressão do r2TNF. Já nas CMSP, as não gestantes apresentaram em todos os grupos maior expressão do r1TNF e as gestantes expressaram o rLTXβ. Na avaliação das moléculas da via do NFkB nos neuroblastomas, a molécula FADD foi mais expressa que a molécula TRAF em todos os grupos de estudo, e esse padrão foi semelhante na comparação entre a expressão da molécula NIK e JNK, sendo a molécula de maior expressão das moléculas finais da via foi o c-Rel. Na avaliação das moléculas da via do NFkB nas CMSP tanto das gestantes quanto das não gestantes, não houve diferenças significativas dentro de cada grupo, sendo que os níveis expressos de cada molécula foram semelhantes. Na avaliação da expressão das moléculas ligadas às vias do NFkB, no controle (basal) os neuroblastomas expressaram constitutivamente o rLTXβ, FADD, NIK, IkB e c-Rel, com produção de IL-8 e IL-6. E nas CMSP das não gestantes o receptor de maior expressão foi o r1TNF e nas gestantes o rLTXβ, como também a produção de IL-6, IL-8, IL-1β, TNF e as quimiocina MCP-1 e RANTES. Nas CMSP, não houve diferença na expressão das outras moléculas da via. Na incubação com o vírus Zika, houve maior expressão do cRel nos neuroblastomas e menor expressão de relB, com produção aumentada de IL-8 e IL-6. Nas CMSP houve maior expressão do relA em não gestantes, e maior produção de IL-8, TNF, MCP-1 e nas gestantes houve maior produção de IL-8, IL-6, TNF e IL1β. No tratamento com o atazanavir, nos neuroblastomas o c-Rel continuou mais expresso, porém notou-se aumento na expressão da molécula P52, com redução de IL-6, mantendo os níveis de IL-8. Já nas CMSP, as não gestantes apresentaram maior expressão da molécula P52, sem variação na expressão das citocinas e nas gestantes houve maior expressão da molécula relA, com aumento na produção de IL-8. No grupo atazanavir+zika, para os neuroblastomas, o c-rel continuou a ser a molécula mais expressa, porém, o P52 apresentou aumento e não apresentou diferença na expressão de IL-6 e IL-8 e nas CMSP a molécula mais expressa foi relA para não gestantes, sem alteração na produção das citocinas e também para gestantes, com aumento de IL-8 e IL-1β. No tratamento com a curcumina, o c-Rel continuou a ser a molécula mais expressa pelos neuroblastomas, porém teve aumento da molécula P52 e do relA e redução na produção da IL-6 e IL-8 e nas CMSP, tanto as gestantes quanto as não gestantes, expressaram relA e não modificaram a produção das citocinas. No grupo curcumina+Zika, os neuroblastoma continuaram a expressar o c-Rel, com aumento de relA e P52 e não modificaram a produção de citocinas, e as CMSP apresentaram maior expressão do relA, tanto em não gestantes, que aumentaram IL-8 e IL1β quanto em gestantes, que produziram mais IL-6, IL-8 e IL-1β. No tratamento com o lopinavir, os neuroblastomas apresentaram apenas a molécula c-Rel elevada, com redução de IL-6 e sem alteração de IL-8 e as CMSP das não gestantes, não apresentaram diferença na expressão dessas moléculas e as gestantes continuaram a expressar o relA mais elevado que as outras e em relação as citocinas, não houve modificação na produção. No grupo lopinavir+Zika, os neuroblastomas expressaram c-Rel e maior expressão de P52, sem modificar a expressão de citocinas e nas CMSP, as não gestantes não mostraram diferenças de expressão das moléculas e na produção de citocinas e as gestantes apresentaram o relA mais elevado e aumrnto de IL-8. CONCLUSÕES Pela microscopia eletrônica foi confirmado que o vírus Zika infecta os neuroblastomas. A inibição direta do crescimento do vírus mostrou que o atazanavir, a curcumina e o lopinavir podem ter uma ação direta reduzindo o crescimento do vírus Zika. Os neuroblastomas apresentaram perfil de respostas de citocinas de moléculas da via do NfkB diferente das CMSP de gestantes e não gestantes, sugerindo que os mecanismos imunopatogênicos do vírus Zika foram diferentes. O perfil de ativação do NFkB foi sugestivo para a via não canônica em neuroblastoma e nas CMSP de gestantes, por expressarem o rLTXβ, porém as moléculas ativados juntamente com esse receptor, mostram um perfil que tende para a via canônica e a incubação com o vírus mostrou que os neuroblastomas tendem a uma resposta pelo r2TNF, destacando seu perfil canônico. As CMSP de não gestante expressaram o r1TNF, com ou sem infecção viral, o que nos sugere uma resposta canônica. As citocinas detectadas nesse estudo e que também sofreram variação têm perfil de ativação canônico. Os compostos estudados não afetaram o tipo de resposta, mas atuaram na intensidade responsiva das células. Estudos da imunopatogenese do vírus Zika e que verifiquem a modulação, por meio das drogas, da intensidade de respostas dessas células à infecção viral e também à condição gestacional são necessários para definir a utilização dessas drogas para utilização no tratamento da infecção pelo vírus Zika. A utilização da curcumina como suplementação na gestação e ou uso do atazanavir ou lopinavir para tratamento visariam amenizar ou proteger o feto de uma das piores consequências da doença Zika, que é a microcefalia, mas para esse objetivo ser alcançado requer ainda mais estudos desses compostos.

MEMBROS DA BANCA:
Interna - 2223020 - ANAMELIA LORENZETTI BOCCA
Externo à Instituição - CARLOS DOS SANTOS KUCKELHAUS - SESDF
Externa à Instituição - ERICA ALESSANDRA ROCHA ALVES - FIOCRUZ-MG
Externa ao Programa - 2499462 - FABIANA PIRANI CARNEIRO - nullPresidente - 6404463 - MARIA IMACULADA MUNIZ BARBOZA JUNQUEIRA