Banca de DEFESA: Beatriz Santos Argôlo Rodrigues

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Beatriz Santos Argôlo Rodrigues
DATA : 01/12/2023
HORA: 14:00
LOCAL: Auditório 02 do Instituto de Biologia
TÍTULO:

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS PROTEASES RECOMBINANTES QUIMIOTRIPSINA-LIKE PROTEASE (MPRO) E PAPAÍNA-LIKE PROTEASE (PLPRO) DE SARS-COV-2 E PROSPECÇÃO DE MOLÉCULAS INIBITÓRIAS 

PALAVRAS-CHAVES:

SARS-CoV-2; protease viral; Mpro; PLpro; inibidores; óleos essenciais.

PÁGINAS: 100
RESUMO:

O vírus SARS-CoV-2 é o agente patológico da pandemia de COVID-19, responsável por 635 milhões de casos e 6 milhões de óbitos até novembro de 2022. Em contrapartida ao avanço da pandemia, pesquisas de medicamentos antivirais foram iniciadas com foco nas proteases virais por seu papel essencial na replicação. Entre os alvos do SARS-CoV-2, a Main protease - Mpro, é uma cisteína-protease de 33 kDa, responsável pela clivagem de 16 sítios da poliproteína e comum em diversas espécies de coronavírus, além de não possuir similaridade com quaisquer proteínas humanas. Outro alvo, a Papaína-like protease – PLpro, é uma cisteína-protease de 36 kDa responsável pela clivagem de 3 proteínas virais e 2 reguladores da ação imunológica do hospedeiro.  O presente trabalho objetivou contribuir com novos dados acerca da expressão e atividade in vitro de duas importantes proteases da família Coronaviridae, bem como avaliar sua inibição por compostos naturais. Em relação à Mpro, foram testadas diferentes formas de indução descritas na literatura com a constatação de bons resultados nas induções de 5 e 18 horas a 18°C ± 2 com posterior purificação em coluna de Ni+NTA, confirmado pela técnica de Western blot. Em relação à PLpro, as condições descritas na literatura foram testadas, convergindo para a melhor condição à 18°C por 18 horas com 0,1 mM de IPTG e 1 mM de ZnCl₂. Os testes de atividade enzimática indicaram que o armazenamento à -80°C é o mais efetivo, independente da presença de glicerol. Ainda, observou-se que dentre os tampões avaliados, tanto o tampão HEPES 10 mM pH 7,5 e DTT 5 µM, quanto o tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,6 e DTT 5 µM proporcionaram melhor atividade enzimática. O impacto da adição de diferentes compostos foi avaliado, indicando que o uso de DTT no tampão de atividade apresentou aumento de cerca de 68% da atividade na concentração de 10 µM. Por outro lado, a adição de cloreto de zinco reduziu a atividade enzimática em até 95%. A adição de cloreto de sódio também reduziu em 85% a atividade na concentração utilizada nos tampões de purificação, bem como o imidazol, que reduziu em até 94% a atividade na concentração de 500 µM. Já o EDTA não foi capaz de alterar a atividade enzimática. Dentre os 24 compostos naturais testados, os óleos essenciais de Litsea cubeba, Cananga odorata, Salvia sclarea e Citrus limon apresentaram bons resultados de inibição, atingindo IC₅₀ entre de 53 e 76 µg/mL. O presente trabalho analisou, a partir da literatura, os diferentes padrões de indução para dois importantes alvos da COVID-19, convergindo para um padrão de melhor expressão, bem como analisou diferentes aditivos e tampões para os testes de atividade enzimática, propondo uma composição eficiente para análises futuras que tenham como alvo a PLpro de coronavírus. Por fim, foram indicados pelo menos três óleos essenciais com boa atividade inibitória para mais estudos farmacológicos. 

 

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 2492352 - IZABELA MARQUES DOURADO BASTOS CHARNEAU
Interno - 1316471 - DANIEL MENDES PEREIRA ARDISSON DE ARAUJO
Externa ao Programa - 1930428 - FLAVIA DA SILVA NADER MOTTA - UnBExterna à Instituição - Clênia dos Santos Azevedo - MS