Banca de DEFESA: Júlia Hellena Mendes Ribeiro

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Júlia Hellena Mendes Ribeiro
DATA : 22/01/2024
HORA: 09:00
LOCAL: Auditório da Pós Graduação da Faculdade de Medicina
TÍTULO:

CRISPR-CAS9 PARA ESTUDO DE DOENÇAS GENÉTICAS DO ESQUELETO

PALAVRAS-CHAVES:

CRISPR-Cas9; Edição genética; Síndrome de unha-patela; Células-tronco; Diferenciação condrogênica.

PÁGINAS: 120
RESUMO:

As doenças genéticas esqueléticas são um conjunto de doenças que podem afetar desde os
ossos até os tecidos, possuindo uma manifestação clínica muito variável; são majoritariamente
incuráveis e dependem de tratamentos paliativos. A Síndrome de Nail-Patella (NPS; OMIM:
161200) é uma anomalia autossômica dominante causada por mutações no gene LMX1B, e
apesar de possuir sinais clínicos bem descritos pouco se compreende sobre seus mecanismos
moleculares. Este projeto teve como objetivo principal o desenvolvimento de ferramentas
para estudo da NPS usando CRISPR-Cas9. Devido à expressão precoce do gene durante a
embriogênese, células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) foram inicialmente escolhidas
para o projeto, visando sua edição por meio do sistema CRISPR-Cas9. No entanto, devido à
complexidade dos custos associados à cultura de iPSC, células-tronco mesenquimais (CTM) e
células renais embrionárias (HEK293T) foram escolhidas como alternativa. Testes com
plasmídeos de fluorescência utilizando Lipofectamine™  e Nucleofector™ demonstraram que
tanto as iPSC como as CTM foram viáveis para a entrega de plasmídeos, apesar da taxa de
transfecção inferior à literatura. A inserção dos plasmídeos com sgRNA aumentou a
mortalidade celular, bem como a inserção da puromicina para a seleção dos clones, dessa
forma levanta-se a possibilidade da deleção do gene ser letal para as células.
Concomitantemente foi realizada a otimização da diferenciação condrogênica de células iPS,
facilitando o estudo de doenças genéticas do esqueleto a partir de células pluripotentes. No
tocante à expressão gênica, observou-se que durante a condrogênese o gene SOX9, iniciador
da condrogênese, apresenta o mesmo perfil de LMX1B, sugerindo sua associação. Para análise
do perfil de expressão do gene em células renais utilizou-se as HEK293T Cas9 estáveis e
resistentes à puromicina, coletando-se seu material após transfecção com sgRNA de interesse
e analisando perturbações no genoma. Este projeto possibilitou a definição de protocolos para
transfecção de iPSC e CTM, bem como HEK293T, demonstrando seu potencial de inserção de
plasmídeos. Além disso foi definido também um novo protocolo para diferenciação
condrogênica de iPSC e dados de qPCR evidenciaram ligação entre a expressão de SOX9 e
LMX1B.

MEMBROS DA BANCA:
Interno - 1912768 - FELIPE SALDANHA DE ARAUJO
Presidente - ***.356.791-** - MARIA SUELI SOARES FELIPE - USP
Externa à Instituição - ROSÂNGELA VIEIRA DE ANDRADE - UCB