Banca de DEFESA: GABRIEL GINANI FERREIRA

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : GABRIEL GINANI FERREIRA
DATA : 27/02/2025
HORA: 14:00
LOCAL: A definir, em função da banca
TÍTULO:

Análise de microRNAs séricos em pacientes diagnosticados com Transtorno comportamental do sono REM - estudo de métodos de purificação e quantificação por RT-qPCR e expressão relativa de miR-7 e miR-19b

PALAVRAS-CHAVES:

Transtorno comportamental do sono REM (TCSREM), Doença de Parkinson, microRNA, biomarcador, RT-qPCR, miR-7, miR-19b.

PÁGINAS: 100
RESUMO:

A descoberta de moléculas com expressão alterada no sangue periférico de pacientes diagnosticados com distúrbios neurodegenerativos é tema relevante na neurologia, tanto para fins diagnósticos quanto para prognóstico clínico. Esse conceito aplica-se ao Transtorno comportamental do sono REM (TCREM), um distúrbio caracterizado pela encenação de sonhos, que pode evoluir para outras neuropatologias. Caracterizar moléculas com expressão aberrante contribuirá para a melhor caracterização dessa doença e também para a identificação de indivíduos com risco de conversão fenotípica de TCREM em sinucleinopatias, como a doença de Parkinson, a demência por corpos de Lewy e a atrofia de múltiplos sistemas. Entre os possíveis biomarcadores sanguíneos de TCREM destacam-se os microRNAs, que são RNAs não-codificantes que regulam o conteúdo de RNAs mensageiros em nível pós-transcricional. Contudo, a detecção precisa de miRNAs, especialmente daqueles pouco abundantes, requer ensaios científicos cuidadosamente padronizados para purificar RNAs de outros constituintes do soro e para quantificar os alvos de interesse por RT-qPCR. O presente estudo examinou comparativamente duas metodologias de purificação de RNAs e duas metodologias de RT-qPCR, voltadas à quantificação de microRNAs relevantes na neurobiologia e no diagnóstico do TCREM: miR-7 e miR-19b. Foram utilizados dois grupos experimentais: indivíduos diagnosticados com provável TCREM e indivíduos controles saudáveis. Inicialmente, verificou-se que a purificação de RNAs pela metodologia que utiliza tiocianato de guanidina (Kit miRNeasy Serum Plasma Advanced, Qiagen), método 1, apresenta rendimento significativamente superior à metodologia convencional que utiliza separação de fases aquosa e orgânica por fenol-clorofórmio (miRNeasy Serum Plasma, Qiagen), método 2. Os métodos de purificação 1 e 2 renderam, respectivamente, 1,46 ng/µL versus 0,75 ng/µL (P<0,05) no grupo controle, e 2,22 ng/µL versus 0,639 ng/µL (P<0,05) para o grupo diagnosticado com TCREM. Quanto às metodologias de RT-qPCR, ambas utilizaram o sistema TaqMan e foram executadas com kits comerciais (Applied Biosystems), sendo as reações calibradas pelo controle endógeno miR-21 e pelo controle exógeno spike-in miR-39 de C. elegans. Foram comparados dois sistemas de RT-qPCR: o método denominado tradicional, que utiliza transcrição reversa alvo-específica, e o método que executa uma pré-amplificação dos transcritos de RNA, denominado de sistema Advanced conforme nomenclatura do Kit comercial. O sistema Advanced ofereceu resultados superiores para miR-7, com valores de CT (Threshold cycle) abaixo de 30, enquanto no sistema tradicional os valores de CT ficaram próximos de 35, valor considerado limitante para a precisão do qPCR. As expressões de miR-7 e miR-19b foram significativamente maiores no grupo TCREM em relação ao grupo controle, com valores de acurácia (área sob a curva, area under the curve) AUC=0,93 (P=0,0176) e AUC=0,89 (P=0,025), respectivamente, conforme determinado pela metodologia da curva ROC (Receiver operating characteristics). A análise combinada de miR-7 e miR-19b, como assinatura de microRNAs, também mostrou acurácia satisfatória AUC=0,86 (P=0,0374). Em conclusão, nosso estudo mostrou que é crucial e viável aprimorar as etapas de purificação e de qPCR para melhorar a qualidade da quantificação de microRNAs no soro de indivíduos com TCREM. A metodologia de purificação com tiocianato de guanidida ofereceu rendimento superior de RNAs presentes no soro, assim como o sistema de amplificação ‘Advanced’ permitiu a obtenção de CTs adequados, especialmente para microRNAs menos abundantes, como o miR7. Os dois alvos estudados, miR-7 e miR-19, isoladamente ou em conjunto, calibrados por miR21 e cel-miR-39, demonstraram capacidade para identificar pacientes com TCREM com acurácia acima de 85%. Testes subsequentes em uma nova coorte, com maior número maior de indivíduos, devem ser conduzidos para validar essa assinatura promissora de miRNAs, visandose identificar indivíduos com TCREM. Além disso, esses novos testes também irão verificar se miR-7 e miR-19b podem servir como biomarcadores precisos para a fenoconversão de TCREM em distúrbios neurodegenerativos como a doença de Parkinson, a demência por corpos de Lewy e a atrofia de múltiplos sistemas.

MEMBROS DA BANCA:
Externo ao Programa - 1307139 - FABIANO JOSE FERREIRA DE SANT ANA - nullExterno ao Programa - 1156673 - FELIPE VON GLEHN SILVA - nullExterno à Instituição - FERNANDO FRANCISCO BORGES RESENDE - UNICEPLAC
Externo à Instituição - RAIMUNDO NONATO DELGADO RODRIGUES
Presidente - 1127261 - RICARDO TITZE DE ALMEIDA