Banca de DEFESA: Letícia Santos Abrunhosa

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Letícia Santos Abrunhosa
DATA : 01/06/2023
HORA: 14:30
LOCAL: A definir
TÍTULO:

Clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli

PALAVRAS-CHAVES:

L-asparaginase, Escherichia coli, proteína recombinante, Fusarium proliferatum, expressão heteróloga

PÁGINAS: 100
RESUMO:

“A L-asparaginase é uma enzima utilizada para tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda, que atinge em sua maioria crianças e adolescentes. Atualmente, o Brasil utiliza L-asparaginase importada sem registro na Agência Nacional de Vigilância Sanitária, tornando importante a produção nacional desta enzima e necessária a busca por alternativas de produção. Uma alternativa seria a clonagem e expressão de L-asparaginase de Fusarium proliferatum em Escherichia coli, com objetivo de obtenção de maior produtividade enzimática e diminuição dos custos de produção. Outro fator também importante seria a atenuação dos efeitos adversos causados pelo tratamento com a enzima obtida de fontes procarióticas, já que Fusarium proliferatum é um microorganismo eucarioto. Tendo isso em vista, o objetivo desse trabalho foi realizar a clonagem de L-asparaginase obtida por Fusarium proliferatum e expressá-la em Escherichia coli BL21(DE3). Foi realizada a identificação do gene de L-asparaginase proveniente de Fusarium proliferatum, seguida por síntese em vetor pET-28a(+) com otimização de códons para E. coli e sítios de restrição NdeI/XhoI. Em sequência, houve a transformação para replicação em E. coli. DH10B, com posterior transformação para expressão em E. coli BL21(DE3). Após a confirmação da inserção do vetor no sistema de expressão, foram selecionados clones para serem avaliados quanto à produção de L-asparaginase. Foram utilizados SDS-PAGE e Western Blot para seleção do clone com maior expressão da enzima, com posterior avaliação do melhor método de rompimento celular. Após definido o clone e a condição mais eficiente de rompimento celular, foi realizado screening para otimizar as condições de cultivo, com variação da concentração do indutor IPTG, do tempo pós indução e temperatura de indução. As frações solúvel e insolúvel foram utilizadas para a realização do ensaio enzimático, onde a atividade de asparaginase foi medida pelo método de Nessler e do ß-hidroxamato aspártico.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 2329402 - ANGELICA AMORIM AMATO
Externo à Instituição - FELIX GONÇALVES DE SIQUEIRA
Externa ao Programa - 1529483 - MARIA DE FATIMA BORIN
Interna - 1562111 - PEROLA DE OLIVEIRA MAGALHAES DIAS BATISTA