Banca de DEFESA: Samuel Leite Cardoso

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Samuel Leite Cardoso
DATA : 24/08/2023
HORA: 09:00
LOCAL: Plataforma Zoom
TÍTULO:

PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE L-ASPARAGINASE FÚNGICA EM SISTEMAS DE TECNOLOGIA RECOMBINANTE DE Pichia pastoris

PALAVRAS-CHAVES:

L-asparaginase, Pichia pastoris, proteínas heterólogas, leucemia linfoblástica aguda.

PÁGINAS: 100
RESUMO:

A L-asparaginase é o principal componente terapêutico no combate à Leucemia linfoblástica aguda. Essa enzima catalisa a reação de hidrólise do aminoácido L-asparagina em amônia e ácido aspártico e, a partir de uma diferença metabólica crucial, é capaz de exaurir os níveis extracelulares do aminoácido tornando inviável o crescimento das células tumorais. Disponível no tratamento de leucemia linfoblástica aguda desde a década de 60, a L-asparaginase é produzida atualmente por meio de tecnologia recombinante em sistemas de expressão de proteínas heterólogas de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi, o que impacta diretamente no tratamento e no aparecimento de diversos efeitos adversos, como febre, aumento de reações alérgicas, hepatoxocidade e alterações nas funções da tireoide. Deste modo, a produção de L-asparaginase de organismos eucariotos poderia ser uma estratégia para diminuir os eventos adversos e aumentar a eficácia terapêutica do medicamento. Sendo assim o presente trabalho teve como objetivo principal a produção e a purificação de L-asparaginase recombinante em sistemas de produção de proteínas heterologas de Pichia pastoris. A levedura Pichia pastoris já reconhecida pela capacidade de metabolização de metanol foi utilizada com a integração de uma sequência codificante para L-asparaginase do fungo Fusarium proliferatum. O RNA total fúngico foi primeiramente extraído e convertido em cDNA. Após verificação na literatura e estudo das sequências de L-asparaginase presentes em bases de dados, foi possível construir os primers para amplificação e reconhecimento da sequência de Lasparaginase desejada. Após a confirmação da sequência, vetores PPICZαA foram obtidos da empresa InvitrogenTM e primeiramente clonados em E. coli. Posteriormente à clonagem em E. coli, os vetores foram transformados em cepas de Pichia pastoris X33, na qual possui alta capacidade de metabolização do metanol através da enzima AOX1, mecanismos este explorado para a produção de L-asparaginase. Foram obtidos 21 clones e testados quanto a produção de L-asparaginase, a maior atividade enzimática encontrada intracelularmente foi expressa no clone 9 (2,84 UI/g), seguida pelas atividades nos clones, 12, 4.1,13, 8 e 4. Visando um processo de purificação, a enzima foi extraída com a utilização de sonicador de ponteira e em seguida submetida à Coluna de troca iônica DEAE Q FF 5 mL. Os resultados finais demonstram uma enzima parcialmente purificada que apresenta pH ótimo em torno de 7,0, e Km e Vmax nos valores de 17,44 mM e 5,35 mM/s-1, respectivamente. Deste modo, pode-se confirmar a integração das sequências de L-asparaginase no DNA eucariótico de Pichia pastoris e a produção de uma enzima funcional parcialmente purificada.

MEMBROS DA BANCA:
Externo à Instituição - JOÃO VICENTE BRAGA DE SOUZA - UFAM
Externa à Instituição - LEIA CECILIA DE LIMA FAVARO - EMBRAPA
Externo ao Programa - 1744566 - MAURICIO HOMEM DE MELLO - nullInterna - 1562111 - PEROLA DE OLIVEIRA MAGALHAES DIAS BATISTA
Interna - 1844214 - YRIS MARIA FONSECA BAZZO