Banca de QUALIFICAÇÃO: JOEL ANTONIO CORDEIRO DE ABREU

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : JOEL ANTONIO CORDEIRO DE ABREU
DATA : 04/09/2024
HORA: 15:00
LOCAL: On line - Via Microsoft Teams
TÍTULO:

Expressão heteróloga e caracterização de uma L-asparaginase tipo II de Penicillium cerradense em sistema de expressão de Escherichia coli BL21(DE3) L-ASNaseA/ LASNaseB

PALAVRAS-CHAVES:

Leucemia linfoblástica aguda; enzima; processos fermentativos; corpos de inclusão; biofármaco

PÁGINAS: 100
RESUMO:

L-asparaginase (L-ASNase) é um biofármaco utilizado no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA). Este medicamento promove a hidrólise da asparagina no sangue, levando à morte das células leucêmicas, já que elas são incapazes de sintetizar asparagina. Embora a L-ASNase tenha sido empregada na prática clínica por décadas, muitas reações adversas, como alergias e choque anafilático, são frequentemente relatadas. Estas reações estão relacionadas à origem bacteriana das formulações disponíveis. Nesse cenário, este trabalho visa explorar a biodiversidade dos fungos, na expectativa de obter uma LASNase com menor imunogenicidade. O gene da L-ASNase de Penicillium cerradense (GenBank: MT742156.1) foi utilizado neste estudo. Um vetor pET28-L-ASNasePC contendo o gene da L-ASNase de P. cerradense otimizado para códons com uma sequência de síntese de Tag 6x-His no N-terminal e um sítio de trombina para posterior excisão da tag foi construído. Células competentes de E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o vetor. Dez clones selecionados aleatoriamente tiveram sua confirmação de transformação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e foram cultivados em meio Luria-Bertani (LB), -D-1 tiogalactoriranosídeo (IPTG), a 37 ºC, 200 rpm, durante 18 h. Após a extração de proteínas por sonicação, a expressão de L-ASNase foi avaliada por SDS-PAGE 12% e Western Blotting (WB), utilizando um anticorpo anti-Tag 6x-His. Um clone promissor foi selecionado e a concentração de IPTG, temperatura e tempo pós-indução foram avaliados para obter as melhores condições de expressão de L-ASNase. Finalmente, os extratos de proteínas foram submetidos a SDS-PAGE 12% e a atividade da L-ASNase foi medida ensaio enzimático. Após otimização das condições de cultivo e análise por SDS-PAGE, determinou-se que a melhor condição para realizar a fermentação foi 37 ºC, 0,5 mM de IPTG e 4 h após a indução. Após esta otimização, uma cultura de 200 mL foi toetanol e 1 mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) em tampãoTris-HCl 50 mM, pH 8,6. Os corpos de inclusão solubilizados em tampão contendo ureia a 7M foram purificados por cromatografia de afinidade, usando coluna de níquel (HisTrapTMHP, Cytiva ). A purificação foi confirmada com SDS-PAGE 12%. A atividade enzimática foi realizada após a dessalinização com coluna de dessalinização PD-10 (Cytiva ). Não houve atividade de L-ASNase após a dessalinização. Embora a atividade enzimática não tenha sido detectada, altos níveis de expressão foram confirmados por SDS-PAGE e WB. Técnicas de refolding para recuperação de L-ASNase biologicamente ativa, assim como outras técnicas de expressão serão avaliadas a fim de obter a enzima ativa.

MEMBROS DA BANCA:
Externa à Instituição - CARLOTA DE OLIVEIRA RANGEL YAGUI - USP
Externa à Instituição - NADIA SKORUPA PARACHIN - CEM-BSB
Presidente - 1562111 - PEROLA DE OLIVEIRA MAGALHAES DIAS BATISTA
Interna - 1844214 - YRIS MARIA FONSECA BAZZO