As plantas alimentícias não convencionais (PANCs) desempenham papel relevante no contexto da virologia vegetal por atuarem como hospedeiras alternativas e reservatórios naturais de vírus, inclusive de vírus de ssDNA, como os begomovírus. Por estarem frequentemente presentes em áreas agrícolas, bordaduras e ambientes periurbanos, muitas PANCs mantêm populações virais de forma assintomática ou com sintomas leves, contribuindo para a persistência, diversidade genética e disseminação de vírus em agroecossistemas. Dessa forma, essas plantas podem participar ativamente da dinâmica epidemiológica das viroses, favorecendo eventos de recombinação e emergência de novas variantes virais que podem posteriormente infectar culturas economicamente importantes. Informações sobre taxonomia características biológicas, etiologia de doenças, organização genômica, bem como transmissão e importância destes vírus e ferramentas de estudo são contempladas no Capítulo 1 desta dissertação. Este capítulo apresenta a fundamentação teórica e conceitual do estudo, abordando os principais avanços no uso do Sequenciamento de Alto Rendimento (High Throughput Sequencing – HTS) aplicado à virologia vegetal, com ênfase na detecção e caracterização de vírus de ssDNA. São discutidos os princípios gerais da classificação viral, com destaque para o sistema de Baltimore e para os mecanismos replicativos dos vírus de DNA fita simples. O capítulo descreve os principais processos envolvidos na variabilidade genética viral, como mutação e recombinação, enfatizando sua relevância na evolução de vírus fitopatogênicos. A família Geminiviridae é apresentada como um dos grupos mais importantes de vírus de plantas, com foco no gênero Begomovirus, suas características genômicas, formas de organização e critérios taxonômicos. Também é abordado o papel das plantas alimentícias não convencionais, plantas medicinais e plantas daninhas como hospedeiras e potenciais reservatórios virais em agroecossistemas, destacando sua importância na dinâmica epidemiológica dos vírus de ssDNA. O capítulo estabelece, assim, a base conceitual necessária para a compreensão dos objetivos e das abordagens metodológicas adotadas nos capítulos subsequentes. (Capítulo 2).18 Primers espécieespecíficos foram desenhados e utilizados para a recuperação parcial ou completa de genomas virais de DNA circular associados a plantas, com foco em vírus de ssDNA pertencentes principalmente à família Geminiviridae, além de representantes de gemycircularvírus. Os primers foram desenvolvidos a partir de sequências obtidas por análises de HTS, visando a amplificação do componente DNA-A de vírus previamente descritos e de potenciais novas espécies. Para a espécie Tobacco mottle leaf curl virus, primers específicos foram empregados para a amplificação parcial do DNA-A, resultando em um amplicon de 2.534 pb; utilizado na PCR para a qual as amostras DF636 (melão), L1728 (amendoim), O2735 (amendoim) foram posistivas. Adicionalmente, conjuntos de primers foram desenhados para diferentes contigs associados a espécies virais novas ou ainda não classificadas, permitindo a recuperação tanto de genomas completos quanto parciais. Entre esses, destacam-se primers direcionados ao contig 317, correspondente a um provável novo gênero, que possibilitaram a amplificação de um genoma completo com aproximadamente 2.854 pb. Outros conjuntos de primers foram aplicados para a amplificação de regiões parciais do DNA-A associadas aos contigs 162, 143, 844 e 141, com tamanhos de amplicons variando entre 1.329 e 2.483 pb, enquanto primers específicos para os contigs 215 e 139 permitiram a recuperação completa do DNA-A, com amplicons superiores a 2.600 pb. Além dos begomovírus e vírus relacionados, primers espécie-específicos também foram utilizados para a recuperação do genoma completo de um gemycircularvírus associado ao contig 21895, resultando em um amplicon de 2.106 pb

A biomassa lignocelulósica derivada de resíduos agroindustriais, como o bagaço de cana-de-açúcar, constitui matériaprima abundante e estratégica para biorrefinarias de segunda geração, com potencial para produção de biocombustíveis e compostos de alto valor agregado. Contudo, a recalcitrância estrutural da parede celular vegetal formada por uma matriz complexa de celulose, hemicelulose, lignina e pectina impõe barreiras físico-químicas à sua bioconversão eficiente. A pectina, embora frequentemente subvalorizada em biomassa herbácea, desempenha papel estrutural relevante na organização e acessibilidade da parede celular, influenciando a exposição dos polímeros estruturais à ação enzimática. Nesse contexto, fungos lignocelulolíticos destacam-se pela capacidade de secretar sistemas enzimáticos coordenados; entretanto, sua produção em monocultivo pode limitar a diversidade funcional do secretoma. O presente estudo investigou as interações interespecíficas em sistema modelo de cocultivo fúngico poderiam modular o perfil secretório e impactar o desempenho hidrolítico em bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente, foi conduzido screening morfológico em meio sólido envolvendo Trichoderma reesei RUT-C30 e diferentes fungos saprofíticos, seguido de triagem funcional em meio líquido com determinação das atividades de CMCase, mananase, pectinase e xilanase. O sistema envolvendo Trichoderma reesei RUT-C30 e Pleurotus citrinopileatus foi selecionado como modelo para caracterização cinética ampliada (9 e 15 dias), avaliação da influência do pH, ensaios de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar e análise proteômica global por LC–MS/MS. No screening funcional, as atividades celulolítica (CMCase), xilanolítica e mananolítica no cocultivo apresentaram perfis semelhantes ao monocultivo de T. reesei, não evidenciando amplificação global das enzimas hidrolíticas clássicas. Em contraste, observou-se padrão consistente de aumento da atividade pectinolítica no cocultivo, confirmado sob maior robustez experimental no ensaio de 15 dias, com diferença estatisticamente significativa no dia 12. A dinâmica temporal revelou sucessão funcional do secretoma, caracterizada por atividade xilanolítica precoce e intensificação tardia das atividades celulolítica e mananolítica. A condição de pH 6 proporcionou maior desempenho enzimático global. Nos ensaios de hidrólise do bagaço, o sistema de cocultivo apresentou desempenho comparável ao monocultivo de T. reesei, sem redução da eficiência sacarolítica, corroborando que a modulação observada não compromete a capacidade global de conversão do substrato. A proteômica qualitativa identificou 305 proteínas de alta confiança, incluindo repertório diversificado de enzimas carboidrato-ativas (CAZy), como glicosil hidrolases associadas à degradação de celulose e hemicelulose, enzimas pectinolíticas e proteínas acessórias envolvidas na modificação da matriz da parede celular. A atribuição taxonômica evidenciou contribuição diferencial entre os organismos, com maior densidade relativa de CAZymes associadas a P. citrinopileatus, especialmente enzimas relacionadas à degradação e remodelamento de polissacarídeos pécticos. Embora a abordagem agregada não permita inferência quantitativa por tratamento, o perfil funcional identificado fornece plausibilidade mecanística consistente para a assinatura pectinolítica observada experimentalmente. Em conjunto, os resultados indicam que o cocultivo não promove amplificação indiscriminada das atividades hidrolíticas, mas sim reorganização seletiva do secretoma, com modulação setorial consistente no eixo pectinolítico. A evidência sugere que a modulação da fração péctica pode representar estratégia relevante para otimização da acessibilidade estrutural da biomassa lignocelulósica. O estudo estabelece base experimental robusta para aprofundamento por proteômica quantitativa e integração multiômica, contribuindo para o entendimento dos mecanismos regulatórios envolvidos na bioconversão do bagaço de cana-de-açúcar e para o desenvolvimento racional de consórcios fúngicos aplicáveis a biorrefinarias lignocelulósicas.

A adoção de tecnologias de base renovável tem se tornado cada vez mais urgente diante dos efeitos das mudanças climáticas e dos impactos ambientais associados ao uso intensivo de recursos fósseis. Em resposta a esses desafios, cresce o interesse por soluções biotecnológicas como alternativas sustentáveis às rotas petroquímicas tradicionais, com potencial para reduzir emissões, valorizar subprodutos agroindustriais e diversificar a matriz produtiva. Nesse contexto, este trabalho consolidou estratégias para o desenvolvimento sistemático de bioprocessos, empregando duas linhagens engenheiradas da levedura Komagataella phaffii, produtoras de etilenoglicol (EG) e de 1,2,4-butanotriol (BTO), como modelos de estudo. A abordagem adotada combinou engenharia da linhagem, formulação de meios de cultivo, definição de parâmetros operacionais, análises metabólicas, cinéticas e termodinâmicas, modelagem matemática e experimentos em redução de escala, permitindo integrar resultados provenientes de diferentes perspectivas experimentais e computacionais. A avaliação da disponibilidade de oxigênio demonstrou que condições limitantes favorecem a produção de etilenoglicol e que ajustes na taxa de transferência de oxigênio podem maximizar sua formação. O modelo de compartimentos desenvolvido para um reator industrial de coluna de bolhas permitiu identificar gradientes críticos, caracterizar mecanismos limitantes e definir faixas operacionais adequadas para aplicações industriais. Experimentos de redução de escala reproduziram essas heterogeneidades, avaliando a sensibilidade da levedura às flutuações nos níveis de oxigênio e confirmando seu impacto na seletividade e no desempenho do processo. A otimização sistemática de meios de cultivo resultou na seleção e no refinamento de formulações mais eficazes, com aumentos de até 54% na produção de etilenoglicol e expressiva simplificação da composição química. A investigação de parâmetros operacionais, como as concentrações e as proporções entre os substratos, a densidade celular e o pH, permitiu identificar condições mais favoráveis à maximização da produção. Os ajustes cinéticos descreveram com precisão a coassimilação de glicose e xilose e fundamentaram o desenvolvimento de um modelo dinâmico de batelada alimentada. Esse modelo definiu estratégias de alimentação que resultaram, experimentalmente, no maior título de etilenoglicol obtido para a linhagem, de 13,5 g/L, correspondente a aproximadamente 42% da conversão teórica, mantendo a produtividade e os rendimentos previamente observados. Os resultados alcançados indicam a existência de restrições intrínsecas à via metabólica heteróloga, que limitam o aumento da conversão e da produtividade do processo. A combinação de análises de fluxo, termodinâmica e cinética permitiu identificar os principais pontos restritivos da via metabólica, em especial as enzimas xilonato desidratase e aldolase, cuja baixa eficiência catalítica e elevada demanda proteica impõem limitações ao desempenho global da via. No caso do 1,2,4-butanotriol, a avaliação dos efeitos da disponibilidade de oxigênio, do pH e da concentração celular inicial permitiu identificar a combinação de parâmetros mais favorável à maximização da produção. Sob essas condições otimizadas, a linhagem apresentou um aumento de 147% na concentração obtida em comparação à configuração inicial, atingindo 1,3 g/L. Este trabalho estabelece uma estrutura metodológica aplicável a diferentes bioprocessos, independentemente do produto de interesse ou do microrganismo utilizado. O alcance de níveis de desempenho compatíveis com operações em grande escala depende da integração entre engenharia de processos e engenharia metabólica, que devem atuar de forma complementar e interdependente para superar limitações fisiológicas, explorar o potencial das vias sintéticas e viabilizar a produção biotecnológica em escala industrial.

Os vírus constituem importantes agentes etiológicos de doenças emergentes em diversas culturas agrícolas, incluindo o tomateiro (Solanum lycopersicum). As plantas daninhas, por sua vez, exercem papel fundamental como reservatórios e hospedeiros alternativos, contribuindo para a persistência, diversidade e dispersão de vírus, especialmente aqueles que possuem genoma de DNA de fita simples (ssDNA), como os vírus dos gêneros Begomovirus, Citlodavirus, Mulcrilevirus, Badnavirus, Caulimovirus, Gemycircularvirus e Gemykolovirus. Informações sobre taxonomia características biológicas, etiologia de doenças, organização genômica, bem como transmissão e importância destes vírus e ferramentas de estudo são contempladas no Capítulo 1 desta tese. Com a crescente diversidade de espécies, o uso de ferramentas como o Sequenciamento de Alto Rendimento (High-Throughput Sequencing - HTS) tem possibilitado o estudo detalhado da diversidade viral e tem sido amplamente utilizado de forma consistente. O desenvolvimento e a evolução de novas tecnologias de HTS estão revolucionando a descoberta de vírus, o diagnóstico, os estudos metagenômicos e evolutivos. Dessa forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender o papel das plantas daninhas e associadas ao cultivo do tomateiro como reservatório de vírus de ssDNA, bem como alterações genéticas das populações. Com essa finalidade, foi realizado um levantamento da diversidade genética das populações virais, incluindo begomovírus que ocorrem em plantas daninhas e outras espécies de plantas associadas ao cultivo do tomateiro, pertencentes a 15 famílias botânicas: Asteraceae, Bignoniaceae, Brassicaceae, Cactaceae, Capparaceae, Caricaceae, Cleomaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Malvaceae, Moraceae, Poaceae, Ruscaceae e Solanaceae. Para isso, foram coletadas 114 amostras foliares com sintomas típicos de begomovírus. O DNA total das amostras foi extraído e utilizado como molde para RCA (Rolling Circle Amplification). O conjunto de amostras a partir de RCA foi preparado na forma de um pool de amostras que foi enviado para sequenciamento usando a plataforma NovaSeq6000 na Agrega. Após o sequenciamento, os dados foram analisados utilizando ferramentas de bioinformática. Como resultado proveniente do HTS foram recuperados 19.575.404 reads e 62.444 contigs. Foi possível recuperar 103 sequências virais sendo um total de 99 genomas completos e quatro genomas parciais. As sequências se distribuíram em cinco famílias distintas: Geminiviridae (85 contigs), Caulimoviridade (13 contigs), Genomoviridae (3 contigs), Alphasatellitidae (1 contig) e Circoviridade (1 contig). A família Geminiviridae foi a mais representativa, com três gêneros Begomovirus (83 contigs), Citlodavirus (1 contig), e Mulcrilevirus (1 contig). No gênero Begomovirus (família Geminiviridae) foi possível recuperar sete espécies conhecidas e cinco potenciais novas espécies denominadas: espécie nova #1 (C493), espécie nova #2 (C218), espécie nova #3 (C64), espécie nova #4 (C08) e espécie nova #5 (C329). Além disso, outra espécie nova denominada espécie nova #6 (C1998) (gênero Citlodavirus, família Geminiviridae) foi recuperada nesse pool. Análises para confirmação da hospedeira foram realizadas usando os primers ITS2F e ITS2R (Capítulo 2). Primers espécie-específicos foram empregados para recuperação dos genomas por PCR em cada amostra individualmente. Os resultados obtidos são apresentados e discutidos. A descrição e análise de 06 espécies novas encontra-se organizada por capítulo. Desta forma, informações sobre uma nova espécie, de genoma monopartido, classificada no Begomovirus foi denominada aqui de New species #5 C329 e detectada na amostra PR-134 coletada em 2012 em Capitão Leonidas Marques, Paraná, sul do Brasil. A análise filogenética mostrou que a nova espécie compartilha 84–85% de identidade com outros begomovírus, sendo a identidade filogeneticamente mais próxima de 85% com tomato severe rugose virus – ToSRV [MW596573] (Capítulo 3). No capítulo 4, quatro novas espécies de begomovírus bipartidos recuperadas em HTS, tiveram a organização genômica analisada em detalhe quanto às ORFs e motivo, e foi encontrado o DNA-B correspondente a cada uma delas. A sequência parcial foi sequenciada via Sanger. O DNA-A foi recuperada via PCR com primers espécies-específicos. Isolados das espécies novas #1 (NS#1) e #2 (NS#2) foram detectados em amostras provenientes de Goiás - GO (RGO-835 e RGO-834). Dois isolados da espécie nova #3 (NS#3) foram detectados em amostras do Pará (PR-126 e PR-136). Sete isolados da espécie nova #4 (NS#4) foram identificados em amostras provenientes de três estados brasileiros: Goiás (RGO-836, RGO-838, RGO-834 e RGO-833), Distrito Federal (RDF-826 e RDF-827) e Rio Grande do Sul (RS-082). A análise filogenética demonstrou que NS#1 tem identidade filogenética mais próxima com BGMV (MN822294); NS#2 é filogeneticamente mais próxima de Cleome leaf crumple virus (CleLCrV) (FN4359999); NS#3 é mais próxima de tomato leaf distortion virus (ToLDV) (NC_038474), e NS#4 é mais próxima de Sidastrum golden leaf spot virus – SidGLSV (NC_038462). As análises de recombinação demonstraram existe evidência de recombinação entre as novas espécies NS#3 e NS#4. No capítulo 5 informações sobre o gênero Mulcrilevirus detectado em uma amostra coletada no Distrito Federal (RDF-831) ilustram a importância de estudos HTS para conhecer a diversidade viral no país. Trata-se do primeiro registro desse vírus fora da China. A sequência C93 apresentou 92–93% de identidade (95% de cobertura da consulta) com isolados de Mulcrilevirus mori (= mulberry crinkle leaf virus – MCLV), dentre eles o isolado MN240483.1. No capítulo 6, informações da descrição de uma nova espécie do gênero Citlodavirus são apresentadas. Isolado deste gênero foi detectado em uma amostra do Mato Grosso (MT-012), coletada em 2010 em Cuiabá, na região Centro-Oeste brasileira. A análise filogenética mostrou que a espécie compartilha 72,50% de identidade com Citlodavirus passiflorae (Passion fruit chlorotic mottle virus) [NC_040706.1]. No capítulo 7 é relatada a identificação de CleLCrV em uma amostra coletada no Paraguai (PAR-005), em Major Otaño, no ano de 2010. Trata-se do primeiro registro desse vírus no Paraguai. Esse isolado apresentou de 94,33% de identidade (100% de cobertura) com o isolado de DNA-A de acesso FN435999.1. O capítulo 8 apresenta o primeiro relato de um vírus do gênero Gemycircularvirus em repolho e malva, coletadas em 2022, uma na região do Distrito Federal (DF-284) e outra no estado do Goiás (RGO-834). Esse é o primeiro registro nessas hospedeiras. O isolado apresentou 91.26% de identidade com Gemycircularvirus mocha1 (Momordica charantia associated Gemycircularvirus; NC_075310.1). No capítulo 9 relata-se a detecção de um vírus do gênero Gemykolovirus em uma amostra coletada em Urutaí, estado de Goiás, em 2022 (RGO-833). O isolado apresentou 88.44% de identidade (56% de cobertura) com um isolado do vírus Gemykolovirus heris1 (Plant associated genomovirus 7 – PaGmV 7) [NC_076273.1]. Trata-se do primeiro relato de PaGmV 7 em Digitaria catamarcensis (Poaceae). Esses resultados reforçam a importância do monitoramento contínuo de plantas daninhas e não cultivadas que crescem nas proximidades das culturas, uma vez que podem atuar como reservatórios de vírus que contribuem para sua disseminação.

A crise mundial de acúmulo de resíduos tóxicos, traz à tona a necessidade de uma forma sustentável de utilização de compostos resultantes de processos industriais, como a lignina Kraft. Este material é produzido por indústrias que utilizam a biomassa lignocelulósica como matéria-prima, como por exemplo indústrias de polpa de papel e celulose. A lignina é uma fonte de compostos aromáticos de interesse industrial por ser renovável. Estudos anteriores reportaram que no rúmen bovino há uma microbiota diversa e altamente especializada na degradação da lignocelulose, indicando que estas comunidades microbianas podem ser constituídas por microrganismos conversores deste tipo de biomassa e assim com potencial em processos industriais que utilizam lignocelulose como matéria-prima. O presente estudo, tem como objetivo identificar e caracterizar bactérias anaeróbias capazes de desconstruir lignina kraft visando agregar valor à lignina. Foram obtidos 19 isolados bacterianos a partir de consórcio bacteriano coletado de rúmen bovino, todos foram cultivados em meio redutor em atmosfera anaeróbica contendo lignina kraft e suplementados com glicose, 0,5%. Para avaliar o consumo da lignina foram analisadas as taxas de descoloração e degradação que foram medidas por quatro dias e comparados para avaliar quais obtinham as maiores taxas de descoloração e degradação após a suplementação de glicose. Os maiores valores de taxa de descoloração de lignina kraft foram obtidos para os isolados denominados IY 2-3, IL 2-2 e ICE 6, 66,6%, 54,35% e 54,46% respectivamente. As taxas de degradação para cada um destes isolados foi de 60,56%, 59,32% e 45,4%, respectivamente. Cinco destes isolados foram selecionados para análises posteriores, 3 com as maiores taxas de descoloração e dois com as menores taxas. Dentre os 5 isolados escolhidos, apenas um apresentou maior crescimento e descoloração na temperatura de 45ºC, os isolados IY 2-3, IL 2-2, IY 2-4 e IL 2-4, apresentaram maior taxa de crescimento na temperatura de 37ºC na qual também foram obtidos os maiores valores de descoloração. Todos os isolados serão identificados utilizando a sequência do gene rDNA 16S, os amplicons já foram obtidos e serão sequenciados pela empresa Macrogen. Visando o mapeamento de proteínas secretadas com papel na desconstrução de lignina kraft, o isolado IY 2-3 que apresentou as maiores taxas de descoloração e degradação, foi cultivado no meio de cultura adequado. O sobrenadante da cultura de 24 horas foi utilizado para estabelecer o método de extração adequado para obtenção das proteínas. A preparação posteriormente será analisada por espectrometria de massa para obtenção do mapa proteico. Estão previstas ainda neste trabalho análises visando visualizar e quantificar a modificação e/ou hidrólise da molécula de lignina e produtos formados pelo seu consumo, utilizando as técnicas de FTIR (colocar por extenso), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa, GCMS. Presumimos que o consórcio microbiano coletado do rúmen bovino tenha a atividade de degradação de lignina confirmadas e as vias metabólicas sejam definidas por meio das análises proteômicas, identificando as etapas envolvidas neste processo, fornecendo informações cruciais para a compreensão dos processos envolvidos na degradação da lignina por estes organismos e o uso deles em escala industrial para a sua utilização em produtos mais sustentáveis.

Fonsecaea pedrosoi é um fungo filamentoso melanizado e a principal causa de cromoblastomicose (CBM). CBM é uma micose subcutânea crônica e recalcitrante causada por implantação traumática e é considerada uma doença tropical negligenciada (DTN). A melanina é sintetizada pela via DHN-melanina (1,8-di-hidroxinaftaleno) e pode ser caracterizada por propriedades como: alto peso molecular, muito estável, carregada negativamente, resistente à degradação por ácidos, suscetível à degradação por bases fortes, hidrofóbica e insolúvel em solventes orgânicos. Esta via começa com o policetídeo 1,3,6,8-tri-hidroxinaftaleno (THN), seguido pela redução para scitalone, que é reduzida para vermelone e desidratada para DHN. Após esta etapa, a DHN é polimerizada para formar a melanina DHN. Portanto, para caracterizar a via DHN-melanina em F. pedrosoi, o gene da proteína policetídeo sintase tipo I (PKS-1), responsável pela primeira etapa da via biossintética da DHN, foi deletado por biolística. Cassetes de deleção foram construídos por reação em cadeia da polimerase de dupla articulação (DJ-PCR), técnica de construção de fragmento de DNA recombinante utilizando a metodologia de PCR para fusão de diferentes fragmentos para obtenção de um cassete para deleção do gene alvo. Obtivemos vinte e cinco transformantes e oito mutantes confirmados ∆pks 1 por PCR e crescimento em placas de meio seletivo. Utilizamos dois mutantes de diferentes transformações como controle para a técnica. O teste de caracterização foi conduzido para o estresse oxidativo, de parede celular, osmótico e UV. Outros testes foram realizados, como: fagocitose, curva de sobrevivência em Galleria mellonella, Óxido Nítrico e ensaios de crescimento

Biomassas lignocelulósicas são abundantes na natureza e apresentam potencial para o desenvolvimento sustentável de bioprodutos de baixo custo. A lignina, um de seus principais componentes, possui estrutura complexa e recalcitrante, o que dificulta seu uso industrial. No entanto, sua bioconversão por microrganismos isolados a partir de ambientes naturais hipersalinos representa uma estratégia promissora. Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar microrganismos, especialmente fungos, capazes de utilizar lignina como fonte de carbono, visando à produção de bioprodutos com aplicação potencial nas indústrias e na agricultura. Amostras de liteira foram coletadas em áreas hipersalinas, salina e apicum, adjacentes a um manguezal do estuário do Rio Vaza-Barris (SE). Elas foram processadas por plaqueamento direto e cultura de enriquecimento em meio líquido contendo lignina Kraft como única fonte de carbono, sob diferentes concentrações de NaCl (0%, 4,5% e 11%). Foram obtidos 88 microrganismos, incluindo 35 fungos filamentosos, dos quais 32 foram identificados taxonomicamente por meio das regiões ITS, β-tubulina e calmodulina, abrangendo 16 gêneros distintos. Os isolados foram avaliados quanto ao crescimento em ligninas industriais (Kraft e organosolv) e em monômeros fenólicos, com e sem adição de NaCl. Também foi realizado um screening para atividade de lacase, e os isolados com melhor desempenho foram selecionados para análises cromatográficas (UPLC-PDA) e de produção de fitohormônios, derivados metilados de AIA, e do regulador de defesas de plantas ácido salicílico (UPLC-MS). Alguns isolados apresentatram resultados positivos quanto à produção desses compostos. Os resultados destacam a capacidade desses fungos em desconstruir lignina e gerar produtos para aplicações biotecnológicas em indústrias e na agricultura

O mercado global de enzimas para aplicação industrial tem se desenvolvido na última década com projeção de aumento de US$ 11,9 bilhões em 2023 para US$ 23,2 bilhões até 2032. O uso de enzimas acessórias para composição de coquetéis enzimáticos de aplicação na indústria sucroalcooleira e de nutrição animal é visto como alternativa sustentável para melhora do aproveitamento energético da matéria orgânica. As monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas auxiliares dependentes de cobre. Seu mecanismo oxidativo permite a ação dessa enzima na superfície da microfibrila cristalina de celulose, onde as cadeias polissacarídicas estão mais fortemente associadas. O fungo Trichoderma harzianum é reconhecido há décadas por sua capacidade em realizar o controle biológico de agentes fitopatogênicos, no entanto, o grande potencial de produção de enzimas ativas sobre carboidrato por esse fungo é de conhecimento mais recente. A caracterização enzimática de proteínas auxiliares oriundas desse fungo é escassa na literatura, assim como a aplicação de tais enzimas em ensaios de sinergismo para hidrólise de substratos insolúveis com a braquiária e o bagaçode-cana. Análises computacionais revelaram a presença de 6 genes codificadores de LPMOs no genoma do isolado T. harzianum TR 274 mantido na coleção de fungos do Laboratório de Enzimologia da UnB, sendo que estas enzimas ainda não foram caracterizadas. O presente trabalho visa a expressão heteróloga das LPMOs dos genes triha 131108 (atividade auxiliar 9) e triha 503137 (atividade auxiliar 11) deste isolado na levedura Komagataella phaffii e do gene triha 503137 em Escherichia coli para possível aplicação industrial. O gene triha 131108 foi obtido por RT-PCR, clonado em pGEM®-T Easy e subclonado em PPIC9. Devido a dificuldade de clonagem do gene triha 503137, esse foi sintetizado quimicamente por uma empresa especializada. Ambas construções foram utilizadas na transformação da levedura K.phaffii por eletroporação. Para expressão da proteína recombinante, a levedura foi cultivada em meio BMGY e inoculada em BMMY com metanol para indução da transcrição. O sobrenadante foi coletado com 24, 48 e 72 e 96 horas de expressão. Para expressão do gene triha 503137 em E.coli, o gene de interesse foi subclonado em pET-28a a partir do vetor PPIC9- LPMO503. A expressão da proteína heteróloga ocorreu em meio autoindutor contendo lactose. Foram coletadas as frações solúveis e insolúveis do cultivo celular após ultrassonicação. Tais amostras foram utilizadas para precipitação de proteínas com TCA/acetona e corridas em gel SDS-PAGE. Os resultados do gel SDS-PAGE da proteína triha 131108 apontaram para a possível expressão da proteína heteróloga em tamanho correto. A proteína LPMO 503 foi expressa com sucesso em E.coli, tendo sido confirmada por western blot. Para determinação do perfil de expressão gênica dos 6 genes de LPMOs de T.harzianum contidos em banco de dados, foi realizado o experimento de qPCR com o fluoróforo SYBR Green. Os resultados preliminares indicam uma maior qualidade na obtenção de dados de expressão relativa ao se utilizar o conjunto de primers dos genes de Actina e a-tubulina como genes de referência em comparação a utilização de actina e fator de elongação alfa. Foi possível também verificar o aumento da expressão dos genes triha 488374 e triha 99387 no cultivo do fungo em bagaço-decana e braquiária.

Resumo em português: Os materiais poliméricos existem desde a antiguidade, mas sua utilização se expandiu significativamente durante a Segunda Guerra Mundial, impulsionada por investimentos em pesquisas que reduziram custos e ampliaram suas aplicações em diversas indústrias. Os plásticos são formados por longas cadeias de macromoléculas provenientes da polimerização de monômeros, podendo ser classificados em naturais, semissintéticos e sintéticos. Em 2023, a produção global de plásticos atingiu 413.8 milhões de toneladas com 90,4% oriundos de fontes fósseis, sendo que apenas 8,7% desses plásticos são reciclados adequadamente. Referente a este cenário, diversas medidas tramitam por organizações governamentais e não-governamentais visando transformar a situação. Desse modo, estratégias que visem convergir a substituição e descontaminação de plásticos em um único processo, apresentam alto potencial sob as perspectivas tecnológica, ecológica, econômica e social. Devido à alta biodiversidade microbiana dos solos, estudos visam identificar e analisar micro-organismos capazes de realizarem a biodegradação de plásticos. Com uma coleção estabelecida de bactérias isoladas do Cerrado capazes de biodegradar polietileno, observou-se também nos genomas dessas bactérias genes responsáveis pela biossíntese do bioplástico polihidroxialcanoato. Com base nesses dados, foram realizadas caracterizações microscópicas e químicas para investigar a produção de bioplástico polihidroxialcanoato a partir do consumo de plásticos de origem petroquímica como única fonte de carbono. A microscopia de varredura e de fluorescência confirmaram a formação de biofilme bacteriano na superfície do plástico, e alterações do perfil químico dos plásticos, observadas por FTIR, 13C RMN e TG/DTG, indicam que houve degradação após a formação do biofilme. A partir desse cultivo, foram realizadas a análise de produção de biopolímero por microscopia de fluorescência e caracterização química por FTIR e DSC. As análises validam a hipótese de que a Comamonas sp. está utilizando plástico como fonte de carbono e produzindo bioplástico a partir desse substrato.

Klebsiella pneumoniae é considerada um dos patógenos mais importantes causadores de infecções entre indivíduos imunocomprometidos. Apesar dessa associação frequente a infecções oportunistas, existem linhagens de K. pneumoniae hipervirulentas (hvKp) associadas a um fenótipo de produção de cápsula hipermucoide e que é capaz de causar infecções agressivas e metastáticas em indivíduos que não apresentam imunocomprometimento. Isso se deve ao fato dessas variantes possuírem uma grande quantidade de fatores de virulência que atuam estrategicamente as capacitando de se multiplicar e de se proteger do sistema imune do hospedeiro. Dentre esses fatores de virulência a cápsula apresenta papel protagonista com estudos mostrando que o metabolismo de diferentes açúcares está intimamente ligado à expressão da cápsula e de outros fatores de patogenicidade em linhagens hvKp. Portanto, nesse trabalho, tivemos por objetivo identificar o papel da utilização de açúcares por linhagens hipervirulentas de K. pneumoniae na expressão de fatores de virulência. Para isso, avaliamos o fitness bacteriano; a produção de biofilme e sideróforos; a capacidade de sobrevivência em soro humano e a expressão de fatores de virulência na presença de diversas fontes de carbono. Foram utilizadas três linhagens de K. pneumoniae, Kp 31 isolada de hemocultura sem fenótipo hipermucóide, Kp 34 isolada de cultura de swab retal com o fenótipo e M93, linhagem derivada de Kp 34 que teve a perda do fenótipo hipermucóide pela inserçãode TnPhoA no gene da fucose isomerase. Com esse estudo, verificou-se que a manose é um açúcar em que as linhagens apresentam um melhor fitness bacteriano e produção de biofilme, embora os isolados apresentem capacidades diferentes de produzir biofilme. As três linhagens apresentam grande produção de sideróforos e o isolado de hemocultura foi o único capaz de sobreviver em soro. Quanto a expressão de fímbrias mrkA observou-se uma expressão mais elevada nas linhagens cultivadas em glicose e manose. O gene fucI, relacionado a expressão de hipermucoviscosidade em linhagens hvKp, não foi expresso pela linhagem Kp 31 e também não foi expresso em glicose.

As bactérias aeróbias formadoras de endósporos (Bafes) são microrganismos grampositivos que possuem um baixo teor de guanina-citosina em seu material genético. São capazes de formar o esporo como estratégia de sobrevivência quando se deparam com condições ambientais desfavoráveis. O esporo consiste na unidade celular vegetativa, com metabolismo reprimido e com maior resistência à temperatura, radiações, agentes químicos e predação de organismos superiores. As Bafes possuem diversas aplicabilidades biotecnológicas: estão presentes na produção de bioinseticidas, detergentes, materiais têxteis, biocombustíveis e na biorremediação de metais pesados. A biorremediação traduz-se por remoção, transformação ou redução de agentes poluentes do meio ambiente, como o petróleo. O petróleo consiste em uma mistura complexa de hidrocarbonetos que é utilizado principalmente como combustível e, devido à alta demanda, são frequentes os acidentes petrolíferos que contaminam solos e mares, que perturbam o ciclo de vida desses ecossistemas. Diante desse cenário, encontrar bactérias que sejam capazes de biodegradar o petróleo e óleo diesel é importante para a construção de um sistema biorremediador eficaz. O objetivo deste trabalho foi selecionar Bafes que fossem capazes de utilizar hidrocarbonetos para obtenção de energia quando ofertados petróleo e óleo diesel S10 como única fonte de carbono. As bactérias utilizadas nesse estudo são Bafes isoladas do solo do Distrito Federal (SDF) que fazem parte do acervo da coleção CBafes do Laboratório de Microbiologia/ LaBafes da Universidade de Brasília. Foram selecionadas 50 linhagens SDF para cultivo. Após a primeira triagem, foram cultivadas 46 linhagens SDF em meio mineral sólido suplementado e óleo diesel como única fonte de carbono. De 46, 9 linhagens apresentaram crescimento em óleo diesel S10 e 5 linhagens foram capazes de crescer no meio contendo petróleo. Foram escolhidas duas linhagens que apresentaram maior crescimento nos meios utilizados e performado testes de quantificação de proteínas totais intracelulares e secretadas, teste qualitativo do consumo bacteriano de petróleo, testes da capacidade de produção de lipases e de biossurfactantes e da habilidade de adesão à hidrocarbonetos. Foram observadas diferenças em relação à concentração de proteínas nos diferentes meios testados, assim como diferenças entre proteínas intracelulares e secretadas. Foi constatada a ausência da formação de biossurfactantes, o que motivou a busca de outro teste que pudesse evidenciar o artifício utilizando pelas linhagens para o contato entre o óleo e a célula, confirmado pelo teste de adesão das linhagens ao óleo diesel. A robusta e extensiva busca por bactérias degradadoras de óleo diesel e petróleo, assim como seus estudos preliminares, proporcionam diversas possibilidades promissoras para pesquisas mais aprofundadas acerca de microrganismos biorremediadores de petróleo e derivados.

Os fosfolipídios são moléculas fundamentais para a estrutura e função da membrana plasmática de células eucarióticas e procarióticas, além de estarem envolvidos no processo de adaptação ao meio ambiente e sinalização celular. Atualmente, diversos estudos exploram as vias de biossíntese de fosfolipídios como potencial alvo terapêutico contra fungos patogênicos, sendo assim, esse estudo teve por objetivo investigar o papel das vias de biossíntese de fosfatidilcolina na virulência do fungo Cryptococcus neoformans, através da construção e caracterização de mutantes knockout para os genes que codificam enzimas putativas de duas vias biossintéticas desse fosfolipídio. Os mutantes foram obtidos através de técnicas moleculares de deleção gênica por Double Joint-Polymerase Chain Reaction (DJ-PCR) e biobalística, e submetidos a testes fenotípicos para avaliar diferentes atributos associados à sua virulência. O mutante do gene OPI3, da via de novo, possui crescimento significativamente afetado na ausência de colina no meio de cultura, enquanto o duplo mutante opi3Δpct1Δ para as duas vias consegue crescer apenas na presença de extrato de levedura, ou em ágar gema de ovo. Ambos os mutantes induzem cápsulas polissacarídicas maiores que o selvagem KN99α, enquanto em testes de suceptibilidade a antifúngicos, o mutante do gene PCT1, da via alternativa Kennedy, apresentou maior suscetibilidade aos antifúngicos da classe dos azóis, como fluconazol e itraconazol. Os resultados indicam que essas vias estão associadas com outros mecanismos celulares, além da manutenção da integridade da membrana plasmática.

A criptococose é uma micose sistêmica causada por leveduras do gênero Cryptococcus, sendo uma das principais doenças invasivas em humanos. Tem sido observado nos últimos anos um aumento do número da incidência de casos de infecções fúngicas, principalmente em pacientes que têm algum tipo de imunocomprometimento. Diversos estudos demonstraram que o aumento no tamanho da cápsula ou formação de células titãs de Cryptococcus spp. podem estar envolvidos em processos crucias da adaptação inicial do fungo aos hospedeiros vertebrados e invertebrados. Ambos os processos reduzem o reconhecimento e/ou fagocitose do fungo e outros mecanismos envolvidos na destruição do fungo pelo sistema imunitário. Além disso, a formação de células titãs sendo capazes de produzir células-filhas com morfogênese comum, possivelmente estão envolvidas nos processos de latência desse patógeno oportunista. As células titãs são um potencial alvo de estudos da interação parasito-hospedeiro e já são citadas como possível fator de virulência no despertar da criptococose. Nosso grupo havia demonstrado que a incubação de células de C. neoformans com fosfolipídios induz não só o aumento no tamanho da cápsula desse fungo, mas também a formação de células titãs. Dessa maneira, o objetivo desse trabalho foi sistematizar as condições para indução da cápsula e também a formação de células titãs em resposta a essas moléculas em resposta a fosfolipídeos em diferentes condições experimentais. Observamos maior crescimento da cápsula do fungo quando esse foi incubado com fosfolipídio L-α-fosfatidilcolina com maior grau de pureza quando o ensaio foi realizado em placas de 96 poços por 72 horas a 30°C, sob agitação. Em relação a formação de células titãs, em todas as condições avaliadas houve obtenção de células titãs quando adicionamos o fosfolipídio P1, no entanto, significativamente maior que as amostras de P2, e que em algumas condições o aumento não foi observado quando incubamos as amostras com P2. Sobre as temperaturas de 37°C e 30°C, não observamos alterações biologicamente diferentes. Não observamos diferenças significativas na capacidade de induzir cápsula ou formação de células titãs na presença ou ausência dos filmes e a presença de 5% de CO2 favoreceu o aumento da indução da cápsula e do corpo celular. Acreditamos que os resultados são promissores, mas que outras análises ainda precisam ser feitas para otimização do protocolo.

SARS-CoV-2, pertence à família Coronaviridae, e abrange vírus que afetam mamíferos e aves. O vírus é o agente etiológico da doença COVID-19, que proporcionou um cenário pandêmico de extrema gravidade que resultou em aproximadamente 640.000.000 casos, deste total, 6.560.000 mortes. A partir deste contexto, diversos grupos de pesquisa em todo o mundo aprimoram ferramentas científicas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas, como a elaboração de testes rápidos. Neste sentido, ao se compreender a real gravidade da pandemia, inicialmente, o presente trabalho buscou desenvolver uma estratégia para elaboração de testes rápidos frente a urgência em medidas diagnósticas eficientes em um tempo escasso, e posteriormente verificar a presença de material genético viral em águas residuárias de Brasília (DF). Incialmente, buscou-se a expressão de genes que codificam parte das proteínas S (porção S1-N) e NC do SARS-CoV-2 em Nicotiana benthamiana, empregando novo vetor viral vegetal baseado agente Pepper ringspot virus (PepRSV); com subsequente purificação das proteínas recombinantes e sua avaliação em testes sorológicos para uma detecção em escala laboratorial de SARS-CoV2. Mediante os resultados, após a purificação, a partir de 1 grama de folhas frescas agroinfiltradas, pôde-se obter 39.5 µg de S1-N e 46.0 µg de NC, valores estes superiores a de outros trabalhos. As referidas proteínas foram aplicadas em testes rápidos preliminares, de forma que os resultados demonstraram que todas as amostras positivas (n=5) apresentaram reatividade positiva, o que demonstra o potencial de aplicação destas proteínas. Posteriormente, mediante análise de águas residuárias, procurou-se identificar a presença de material genético viral de SARS-CoV-2 nos meses de maio e agosto de 2020 com amostras oriundas da Estação de Tratamento de Esgoto – Unidade Asa Norte (CAESB). O estudo proveniente da água de esgoto possibilitou a identificação de material genético principalmente relacionado aos gêneros Alphacoronavirus e Betacoronavirus, entretanto, a primeiro momento não se observou o material genético relacionado à SARSCOV-2 nas condições de trabalho. As informações decorrentes da análise de águas de esgoto apresentaram informações que justificam a necessidade de uma constante vigilância epidemiológica, enquanto as proteínas heterólogas produzidas em N. benthamiana e posteriores ensaios iniciais evidenciam o impacto positivo desta estratégia de produção que pode impactar no desenvolvimento de testes de detecção SARS-CoV-2 confiáveis e de baixo custo com produção em larga escala. Assim, de maneira geral, o presente trabalho permitiu a obtenção de proteínas heterólogas em baixo custo para o desenvolvimento de testes diagnósticos sorológicos precisos para o COVID-19, além da análise do material genético viral em água de esgoto.

A coqueluche é uma doença infecciosa do trato respiratório causada pela bactéria Bordetella pertussis, havendo um surto no Distrito Federal em 2014. A seleção de linhagens com epítopos diferentes das cepas vacinais é uma das hipóteses para explicar o surgimento de casos novos da doença. As fímbrias e a toxina pertussis são consideradas primordiais para a patogênese da coqueluche. O gene que coordena a expressão das fímbrias é o fim3. O promotor ptxP é responsável pela expressão do gene ptx, codificador da toxina PT. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil genotípico das linhagens de B. pertussis circulantes no Distrito Federal e entorno, entre 2012 e 2018 em relação aos genes fim3 e ptx por tipagem molecular. Após o cultivo, extração do DNA e amplificação por PCR, realizou-se o sequenciamento dos genes fim3 e ptx e finalmente a variação alélica foi identificada por MAST. Foi encontrada uma maior frequência do alelo de pouca distribuição mundial fim3-24, sendo este diferente da cepa vacinal, o alelo fim3-1. Além disso, foi identificada uma mudança de padrão alélico fimbrial durante o período de 2012 a 2014, sendo o fim3-24 o predominante a partir de 2014, época essa da epidemia de coqueluche no DF. Todas as linhagens apresentaram o alelo do tipo ptxP-3 e desse modo, diferiram da vacinal, que possui alelo ptxP-2. A presença de ptxP-3 pode ter contribuído para o sucesso na colonização do hospedeiro pelos patógenos analisados, pois linhagens portadoras deste alelo apresentam maior virulência. Os dados indicaram também que o surto em 2014 no DF pode ter ocorrido com influência de ptxP-3 visto que grande parte das mesmas amostras apresentaram seleção de alelos diferentes do vacinal também para o gene fim3. Logo, os dois genes podem ter contribuído no sucesso na circulação das bactérias na população do Distrito Federal. Em sua totalidade, os resultados sugerem a ocorrência de seleção de linhag

Cryptococcus spp é um fungo patogênico que pode causar doença em humanos e outros mamíferos. As duas principais espécies patogênicas humanas desse gênero são C. neoformans e C. gattii. É considerado um patógeno oportunista, pois acomete na maioria das vezes pacientes com sistema imunológico comprometido, principalmente indivíduos com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Em ambas as espécies, a infecção se dá por meio da inalação de propágulos do agente disperso no ar como esporos ou leveduras desidratadas. Ao chegar no pulmão o fungo vai se instalar podendo ou não levar ao desenvolvimento da doença, ou pode se espalhar para outros sítios anatômicos apresentando tropismo pelo sistema nervoso central. Para se estabelecer no hospedeiro, Cryptococcus spp precisa escapar do sistema imunológico do hospedeiro. Para isso ele possui alguns mecanismos de virulência como a sua cápsula de polissacarídeo, a habilidade de crescer a 37°C, produção de melanina e enzimas como fosfolipases, urease e proteases. Esse fungo também é considerado um patógeno intracelular facultativo, uma vez que é capaz de parasitar e se reproduzir em macrófagos do hospedeiro, resistindo às atividades microbicidas dessas células. Os macrófagos são as principais células imunes na resposta a infecção por Cryptococcus spp. Na sua interação com essas células, pode ocorrer a destruição do fungo, a ruptura do macrófago e liberação dos fungos que se replicaram no seu interior, ou o fenômeno de exocitose não-lítica. A partir da necessidade de se entender melhor a relação entre o patógeno e o hospedeiro, esse trabalho tem como objetivo avaliar a interação de isolados clínicos de Cryptococcus spp com os macrófagos bem como avaliar a expressão in vitro de alguns de seus fatores de virulência. Nossos resultados demonstraram que cada isolado se comporta de uma forma diferente apresentando diferentes expressões de fatores de virulência e capacidade de sobreviver a interação com macrófagos murinos. Vimos a exocitose não lítica não tem papel na sobrevivência dos pacientes. E que quantidade de células fagocitadas e capacidade delas de sobreviver a interação com macrófagos tem uma correlação positiva assim como a capacidade de crescimento do fungo tem correlação com a exocitose não lítica. Também conseguimos estabelecer um método quantitativo para a análise da produção de urease em Cryptococcus evidenciado que a produção de urease entre os isolados varia tanto não só em atividade mas também na sua cinética de produção. Com isso vimos que para a ocorrência de exocitose não lítica, a quantidade ou a velocidade de urease produzida não tem correlação.

Metabólitos secundários ou especializados são moléculas não essenciais ao crescimento celular, porém, desempenham grande importância adaptativa para os organismos produtores, como bactérias, fungos e plantas. Bactérias isoladas de solos são conhecidas por sintetizarem uma ampla diversidade de metabólitos especializados com diferentes propriedades físico-químicas. Espécies de Bacillus e gêneros relacionados, coletivamente designadas bactérias aeróbias formadoras de endósporos (Bafes), são promissoras para a busca desses compostos. Porém, relatos sobre a síntese de terpenos por Bafes são deveras escassos na literatura cientifica. O objetivo deste estudo foi analisar, in silico, o potencial genômico para produção de terpenos em dez linhagens de Bafes isoladas do solo do Distrito Federal (linhagens SDF). O software antiSMASH 6.0 foi utilizado para rastrear a informação genética envolvida na síntese de metabólitos especializados, conhecidos como biosyntethtic gene clusters (BGC). A reconstrução metabólica para detectar a presença das enzimas da via metil-eritrotol fosfato (MEP), responsáveis pela síntese de terpeno em procariotos, também foi investigada empregando a ferramenta Pathway Tools 26.5. Os resultados obtidos apontam que parte das linhagens SDF sondadas possui o aparato genético completo para produção dos terpenos esqualeno, hopanóide e licopeno. Adicionalmente, análises filogenéticas, baseadas em sequências de aminoácidos das terpeno sintases detectadas, revelaram que estes catalisadores são conservados evolutivamente, indicando que o potencial de produção de terpenos é amplamente distribuído em Bafes. Além de terpenos, os resultados obtidos também mostraram que as Bafes são fontes promissoras de policetídeos e peptídeos não ribossomais. Portanto, estas bactérias são boas candidatas para prospecção de novos bioprodutos, notadamente antimicrobianos.

O Brasil se destaca como o maior produtor mundial de café, mais de 50 milhões de sacas de café são produzidas anualmente, após o beneficiamento do café há geração de resíduos (casca, polpa, mucilagem) na mesma proporção, chegando até 50% da produção total. Neste trabalho foi pesquisado o potencial de produção da enzima pectinase pelo Paecilomyces formosus em resíduos de casca de café robusta e a caracterização desta enzima. Em estudo anterior foi constatado que as melhores condições de cultivo são em 20ºC, 87 rpm, pH 4,0, sem suplementação. Foi realizado um screening enzimático, revelando que o pico de produção de pectinase se dá ao sétimo dia. A amostra foi concentrada (1,54UI/mL) e foi realizada uma comparação entre a porção concentrada e o extrato bruto (0,43UI/mL). As melhores condições bioquímicas da pectinase para o pH se deram em faixas ácidas (pH 4-5) e básicas (pH 9-10), a melhor temperatura 60ºC, foi ativado pelos compostos fenólicos ácido transferúlico e ácido tânico, íons de Mn2+, Ca2+ e pelo EDTA. A pectinase se mostrou estável quanto a termoestabilidade até o período de 72 horas nas temperaturas de 30, 60 e 80ºC no extrato bruto e também na fração concentrada em 30 e 60ºC. O teste de hidrólise demonstrou capacidade degradação do substrato lignocelulósico pela pectinase, se mantendo até o período final de 24 horas do teste, sendo que não houve nenhuma atividade pectinolítica quando ao teste utilizando a casca de café pré-tratada. Os resultados do presente trabalho demonstraram o potencial de produção de pectinase pelo Paecilomyces formosus, sendo caracterizada, contribuindo com novas informações dentro do cenário biotecnológico, se fazendo necessário mais pesquisas.

Os estudos dos Pucciniales do Cerrado realizados na Coleção Micológica do Herbário UB (CMHUB) levaram à descrição de 25 novas espécies e, mais importante, cinco gêneros novos (Batistopsora, Crossopsorella, Kimuromyces, Pseudocerradoa, Raveneliopsis), além do reestabelecimento do gênero Mimema. Além disso, o conjunto dos Pucciniales na CMHUB supera 10% de seu inventário total, com cerca de 2.500 acessos distribuídos em 167 espécies diferentes. No entanto, praticamente todo o material foi identificado com base em critérios morfotaxonômicos. Assim o objetivo da pesquisa ora reportada visou iniciar de forma sistemática a aplicação do conceito de espécie filogenética à coleção de Pucciniales, levando às indispensáveis análises de filogenia molecular com base em sequências de fragmentos de nuc ITS, nuc rLSU (28S), nuc rSSU (18S) rDNA e Cytochrome-c-oxidase subunit 3 (COX3) de origem mitocondrial. No caso presente reporta-se o resultado de análises filogenéticas moleculares envolvendo os seguintes materiais: 1. As espécies Aplopsora henneni e Phakopsora rossmaniae; 2. Descoberta da segunda espécie de Austropuccinia a qual é parasita de Licania tomentosa (Oití); 3. Análise morfológica e filogenia molecular de nova ferrugem infectando espécie ameaçada de extinção do gênero Coracoralina (= Paepalanthus); 4. Análise morfológica e filogenia molecular da ferrugem de Pouteria ramiflora presentemente alocada no gênero Catenulopsora; 5. Filogenia molecular de Esalque, gênero com alocação presentemente indefinida. 6. Filogenia molecular de Dietelia duguetiae. O resultado das análises motraram que: A. henneni e P. rossmaniae são congenéricas, mas pertencentes a um novo gênero a ser designado Cerradopsora (in press) (Anexo 1). Por outro lado, a análise filogenética de Phakopsora tomentosae mostrou tratar-se de uma segunda espécie do importante gênero Austropuccinia, até agora monoespecífico, contendo apenas Austropuccinia psidii (Anexo 2). O agente da ferrugem de duas espécies de Coracoralina foi identificado como nova espécie de Puccinia solidamente estabelecida ambos morfologicamente, bem como, com base em análises filogenéticas moleculares. Catenulopsora hennenae foi reavaliada morfologicamente e mostrada filogeneticamente próxima de espécies de Cerradopsora (Anexo 1), dentro da subordem Raveneliineae. O mesmo ocorreu com o gênero mono-específico Esalque, espécie tipo Esalque holwayi, antes morfologicamente bem estudado e Dietelia duguetiae necessitando mais detalhes morfológicos, porém, ambas necessitando de análises filogenéticas. O resultado indicou que Esalque não se tratava de um membro da família Raveleniaceae, conforme Hennen et al. (2000), mas sim foi alocado em Família incertae sedis dentro de Raveneliineae ao lado de Neopuccinia e Allodus. Já a espécie D. duguetiae, parasita de Duguetia furfuracea (Annonaceae) foi morfologicamente reestudada e filogeneticamente inserida na família Sphaerophragmiaceae, confirmando o achado de Zhao et al. (2020) e de Aime e McTaggart (2021). A maioria dos fungos causadores de ferrugens em Annonaceae estão posicionados na família Spaherophragmiaceae. Assim foi para D. duguetiae e para o agente de ferrugem de Cardiopetalum calophyllum (Annonaceae), ainda ser classificado.

A meningoencefalite causada pelo fungo Cryptococcus neoformans em pacientes imunocomprometidos, principalmente em pacientes com HIV, tem causado aproximadamente 122 mil mortes por ano. Os mecanismos de infecção e sua virulência são objeto de intensa investigação. A melanização do fungo é um dos fatores que aumenta sua virulência, e é catalisada por uma enzima chamada lacase 1 (Lac1). Além da atividade descrita, constatou-se que essa enzima pode ser um dos fatores que permite a sobrevivência do fungo no próprio líquido cefalorraquidiano (LCR), contribuindo para sua permanência no encéfalo. A levedura, Pichia pastoris, é um bom modelo para produção de proteínas. A cepa X-33 dessa levedura foi transformada por um plasmídeo contendo a sequência codante de Lac1, com o objetivo de produção de lacase recombinante. A expressão da enzima nos transformantes foi testada por ABTS, otimizada por testes de produção temporal e foi visto que, em frasco, diferentes tempos de indução não causam diferença significativas na produção da proteína. Além disso, entendeu-se que a Lac1 possui sensibilidade a alterações de pH, com atividade entre as faixas de 5,1 - 6,1 e que o aumento de escala leva a uma necessidade de aumento da frequência do fluxo de alimentação com o indutor metanol.

A biomassa lignocelulósica é uma fonte renovável de energia que apresenta grande potencial para a produção de biocombustíveis e compostos químicos de forma mais sustentável. Coquetéis enzimáticos contendo diferentes classes de enzimas lignocelulolíticas (celulases, hemicelulases e proteínas auxiliares) são necessários para desconstrução da biomassa e liberação dos açúcares presentes em sua composição. Os fungos filamentosos termófilos apresentam um arsenal de enzimas que podem ser aplicadas nestes coquetéis e em outros setores da indústria. Neste contexto, o trabalho tem por objetivo avaliar o arsenal enzimático de Humicola grisea var. thermoidea, caracterizar enzimas termofílicas de fungos filamentosos e avaliar suas possíveis aplicações biotecnológicas. Inicialmente, o genoma e o transcriptoma de H. grisea var. thermoidea foram obtidos pela primeira vez. O genoma do fungo apresentou tamanho de 28,75 Mpb, contendo 8736 genes putativos. A análise do seu transcriptoma demonstrou a expressão de mais de 200 genes para enzimas capazes de degradar carboidratos quando cultivado em fonte de carbono indutora (bagaço de cana), e também a expressão diferencial de genes quando o fungo foi cultivado em pH alcalino (pH 8) ao invés de ácido (pH 5). Paralelamente, buscou-se a expressão e caracterização de uma pectinase e uma esterase putativas do fungo termofílico Thermomyces lanuginosus. A levedura Komagataella phaffii foi utilizada para expressar os genes que codificam uma poligalacturonase (TL-PG1) e feruloil esterase (TL-FE1). Os genes foram clonados no vetor de expressão pPICZA sob controle do promotor AOX1. Clones recombinantes foram obtidos com sucesso e a expressão da proteína heteróloga confirmada por SDSPAGE e Western-blot. As enzimas TL-PG1 e TL-FE1 foram detectadas por ambas as técnicas e purificadas em coluna de afinidade His-tag, atingindo concentrações de 1,45 e 0,76 mg/mL, respectivamente. A enzima TL-PG1 possui atividade de 462,6 U/mL empregando o ácido poligalacturônico (PGA) como substrato sob condições ideais (pH 6 e 55 ˚C). Além disso, TL-PG1 demonstrou sinergia na hidrólise da biomassa lignocelulósica quando usada em conjunto com Ctec3 e eficiência na purga de tecido (denim) para aplicação na indústria têxtil. Por fim, foi desenvolvido um método em pequena escala para avaliar o potencial de liquefação à base de enzimas de pellets derivados do milho. Esse método permitiu a avaliação do efeito de proteínas heterólogas (produzidas previamente) na liquefação enzimática da biomassa peletizada da palha de milho.

O etileno glicol é uma molécula versátil produzida na indústria petroquímica e amplamente utilizada na fabricação de polímeros plásticos (PET), anticongelantes, e fluidos automotivos. Também pode ser utilizado como monômero bloco construtor para a produção de moléculas na indústria química e farmacêutica. Atualmente, a produção de etileno glicol é química ou semibiológica, o que gera impacto negativo no meio ambiente. A produção biotecnológica de etileno glicol pode ocorrer por vias sintéticas através da redução de glicoaldeído, utilizando xilose como substrato, açúcar presente em hidrolisados de biomassa de cana de açúcar. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo desenvolver um processo de produção de etileno glicol a partir de xilose, utilizando a levedura Komagataella phaffii como plataforma. Uma via metabólica sintética de produção de etileno glicol baseada nas enzimas xilose desidrogenase (XDH), xilonato desidratase (XD), aldolase (ALDO) e aldose redutase (ALDR) foi construída in sílico e implementada pela expressão em K. phaffii X-33. A funcionalidade da via de produção de etileno glicol foi avaliada in vivo através de experimentos de fermentação com linhagens recombinantes de K. phaffii em frasco e biorreator. Além de identificar e avaliar a funcionalidade de novas sequências codificantes para enzimas XD, foi analisado o efeito de diferentes combinações de XDH e XD na produção de EG em linhagens recombinantes de K. phaffii. Todas as linhagens construídas foram capazes de metabolizar a xilose, em meio definido, com produção máxima de etileno glicol de 1,34 g/L, resultados que mostram a funcionalidade da nova via sintética. Uma nova XD identificada nesse trabalho permitiu produção de EG 30% maior que a linhagem expressando a XD controle. Finalmente, diferentes condições de cultivo foram testadas, e gargalos na via metabólica foram identificados, possibilitando um maior entendimento a respeito do metabolismo de K. phaffii. Os resultados gerados nesse trabalho contribuem para o desenvolvimento de um processo de produção de EG por rota biológica a partir de recurso renovável.