Os ácidos graxos de cadeia curta (Short-Chain Fatty Acids - SCFAs) são os principais metabólitos da microbiota intestinal e possuem repercussão na manutenção da homeostase sistêmica, a partir de efeitos que perpassam a modulação da expressão gênica e metabolismo celular. Seu papel nas relações patógeno-hospedeiro envolve efeitos imunomodulatórios especialmente nos fagocíticos, promovendo o equilíbrio pró- e antiinflamatório. Estudos preliminares sobre o papel dos SCFAs em infecções bacterianas e fúngicas sugerem que macrófagos possuem capacidade fungicida aumentada. Entretanto, ainda não há registros do efeito de SCFAs em Paracoccidioides brasiliensis, uma das espécies responsáveis pela Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a principal micose sistêmica no Brasil e América Latina, e cujo tratamento inclui eventos adversos, longa duração e resistência a antifúngicos, o que torna cada vez mais necessária a busca por alternativas terapêuticas para a patologia. Destarte, o objetivo da pesquisa é avaliar o potencial papel imunomodulador dos SCFAs na atividade de macrófagos infectados por leveduras de P. brasiliensis. Macrófagos murinos de linhagem imortalizada e primários foram tratados com Acetato, Propionato ou Butirato de Sódio e infectados in vitro com leveduras do isolado Pb18. A produção de citocinas e óxido nítrico (NO) foi avaliada pelos ensaios ELISA e Griess, respectivamente, por 24 e 48 horas. Adicionalmente, avaliou-se a capacidade fungicida de macrófagos e o papel da acidificação do fagolisossomo nesse processo, Como resultados, foi possível apontar inibição na secreção de TNF-α e IL-10 e aumento na secreção de IL-1β por macrófagos infectados tratados com SCFAs, em relação aos grupos não tratados. Além disso, o tratamento com SCFA promove uma aumentada capacidade fungicida dependente da acidificação do fagolisosomo. Como considerações parciais, portanto, os SCFAs mostraram inibir a secreção de citocinas pró/anti-inflamatórias na infecção de macrófagos por P. brasiliensis e, além disso, a acidificação do fagolisossomo é necessária para a atividade fungicida induzida por SCFAs. Os achados, portanto, sugerem um papel imunomodulador dos SCFAs nesses fagócitos.

A enzima L-asparaginase é utilizada no tratamento da Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) no Brasil e no Mundo. No Brasil, já se tem um protocolo de tratamento desenvolvido pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA) de 2001, utilizando L -asparaginases de origem bacteriana, principalmente de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi. No entanto, as enzimas de origem procariótica apresentam reações adversas e toxicidade, que podem levar à suspensão de sua utilização no tratamento de LLA em alguns pacientes. Desta forma, ainda existe a demanda por fontes alternativas de L-asparaginases tão eficientes quanto às já comercializadas, mas que apresentem menos reações adversas e toxicidade, assim como, sejam produzidas com maior rendimento. Ainda considerando o cenário no Brasil, o SUS apresenta dificuldade no seu abastecimento uma vez que esta enzima é importada. Neste cenário, a presente proposta de pesquisa teve como meta central a obtenção de enzimas de origem eucariótica, fungos filamentosos P. sizovae e F. proliferatum, por expressão heteróloga para avaliar a sua utilização no desenvolvimento de formulação estável para tratamento de LLA com menos reações adversas e toxicidade e em processo nacional que possa levar à sua produção em larga escala. As sequências dos genes de asparaginases de P. sizovae e F.proliferatum foram obtidos em trabalho anterior, sintetizados e clonados no vetor pET28A pela empresa genone. No presente trabalho, os genes foram subclonados nos vetores da série pSFOXB (pSFOXB1, 11 e 15) , para avaliar a viabilidade de processo de produção por expressão constitutiva em oposição ao indutivo (pET28A). Foram obtidos clones transformantes para cada uma das construções que estão sendo analisados quanto à presença do inserto e posteriormente, serão analisados quanto à produção da proteína de interesse, presença e atividade. Uma vez obtidas as asparaginases heterólogas estas serão avaliadas na formulação de um fármaco à base de Lasparaginase, meta do projeto no qual a presente proposta de pesquisa está inserida. Dentre estas análises serão realizados estudos de toxicidade e melhoramento de fármacos através de modificações químicas ou moleculares no produto original, visando redução da toxicidade do produto final, redução da imunogenicidade e alterar sua farmacocinética e a farmacodinâmica. 

Os efeitos de longo prazo da adição de nutrientes sobre as comunidades microbianas do solo estão sendo investigados em uma área de Cerrado sensu stricto, localizada na Reserva Ecológica do IBGE (RECOR/IBGE). O experimento contempla cinco tratamentos distintos: controle (sem adição de nutrientes), cálcio (Ca), nitrogênio (N), nitrogênio + fósforo (NP) e fósforo (P). O objetivo do estudo é compreender de que forma a adição contínua de diferentes nutrientes altera os atributos físico-químicos e biológicos do solo. Diversas abordagens foram utilizadas para essa avaliação. A qualidade nutricional do solo foi analisada por meio da determinação de macro e micronutrientes e da atividade de enzimas-chave dos ciclos do carbono, fósforo e enxofre (beta-glicosidase, fosfatase ácida e arilsulfatase). A qualidade geral do solo foi estimada utilizando o índice BioAS, integrando dados físicos, químicos e biológicos. A estrutura e diversidade das comunidades microbianas foram avaliadas por meio de metagenômica, com foco na abundância relativa de fungos e bactérias. Os resultados revelaram que todos os tratamentos com adição de nutrientes promoveram alterações significativas no solo em comparação ao controle. A calagem (Ca) foi o tratamento que apresentou os efeitos mais abrangentes, principalmente na melhoria da disponibilidade de nutrientes, aumento da atividade enzimática e favorecimento de comunidades microbianas benéficas. No entanto, os tratamentos com nitrogênio (N), fósforo (P) e a combinação NP também demonstraram impactos importantes, particularmente sobre a composição e diversidade das comunidades microbianas, além de respostas específicas em parâmetros bioquímicos do solo. Esses resultados indicam que, embora a calagem seja fundamental para a correção da acidez e melhoria geral da qualidade do solo, a adição de N e P contribui de forma complementar, promovendo mudanças na estrutura e função microbiana que refletem diretamente na sustentabilidade e funcionamento ecológico do solo do Cerrado.

O mercado global de enzimas para aplicação industrial tem se desenvolvido na última década com projeção de aumento de US$ 11,9 bilhões em 2023 para US$ 23,2 bilhões até 2032. O uso de enzimas acessórias para composição de coquetéis enzimáticos de aplicação na indústria sucroalcooleira e de nutrição animal é visto como alternativa sustentável para melhora do aproveitamento energético da matéria orgânica. As monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas auxiliares dependentes de cobre. Seu mecanismo oxidativo permite a ação dessa enzima na superfície da microfibrila cristalina de celulose, onde as cadeias polissacarídicas estão mais fortemente associadas. O fungo Trichoderma harzianum é reconhecido há décadas por sua capacidade em realizar o controle biológico de agentes fitopatogênicos, no entanto, o grande potencial de produção de enzimas ativas sobre carboidrato por esse fungo é de conhecimento mais recente. A caracterização enzimática de proteínas auxiliares oriundas desse fungo é escassa na literatura, assim como a aplicação de tais enzimas em ensaios de sinergismo para hidrólise de substratos insolúveis com a braquiária e o bagaçode-cana. Análises computacionais revelaram a presença de 6 genes codificadores de LPMOs no genoma do isolado T. harzianum TR 274 mantido na coleção de fungos do Laboratório de Enzimologia da UnB, sendo que estas enzimas ainda não foram caracterizadas. O presente trabalho visa a expressão heteróloga das LPMOs dos genes triha 131108 (atividade auxiliar 9) e triha 503137 (atividade auxiliar 11) deste isolado na levedura Komagataella phaffii e do gene triha 503137 em Escherichia coli para possível aplicação industrial. O gene triha 131108 foi obtido por RT-PCR, clonado em pGEM®-T Easy e subclonado em PPIC9. Devido a dificuldade de clonagem do gene triha 503137, esse foi sintetizado quimicamente por uma empresa especializada. Ambas construções foram utilizadas na transformação da levedura K.phaffii por eletroporação. Para expressão da proteína recombinante, a levedura foi cultivada em meio BMGY e inoculada em BMMY com metanol para indução da transcrição. O sobrenadante foi coletado com 24, 48 e 72 e 96 horas de expressão. Para expressão do gene triha 503137 em E.coli, o gene de interesse foi subclonado em pET-28a a partir do vetor PPIC9- LPMO503. A expressão da proteína heteróloga ocorreu em meio autoindutor contendo lactose. Foram coletadas as frações solúveis e insolúveis do cultivo celular após ultrassonicação. Tais amostras foram utilizadas para precipitação de proteínas com TCA/acetona e corridas em gel SDS-PAGE. Os resultados do gel SDS-PAGE da proteína triha 131108 apontaram para a possível expressão da proteína heteróloga em tamanho correto. A proteína LPMO 503 foi expressa com sucesso em E.coli, tendo sido confirmada por western blot. Para determinação do perfil de expressão gênica dos 6 genes de LPMOs de T.harzianum contidos em banco de dados, foi realizado o experimento de qPCR com o fluoróforo SYBR Green. Os resultados preliminares indicam uma maior qualidade na obtenção de dados de expressão relativa ao se utilizar o conjunto de primers dos genes de Actina e a-tubulina como genes de referência em comparação a utilização de actina e fator de elongação alfa. Foi possível também verificar o aumento da expressão dos genes triha 488374 e triha 99387 no cultivo do fungo em bagaço-decana e braquiária.

Biomassas lignocelulósicas são abundantes na natureza e apresentam potencial para o desenvolvimento sustentável de bioprodutos de baixo custo. A lignina, um de seus principais componentes, possui estrutura complexa e recalcitrante, o que dificulta seu uso industrial. No entanto, sua bioconversão por microrganismos isolados a partir de ambientes naturais hipersalinos representa uma estratégia promissora. Este trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar microrganismos, especialmente fungos, capazes de utilizar lignina como fonte de carbono, visando à produção de bioprodutos com aplicação potencial nas indústrias e na agricultura. Amostras de liteira foram coletadas em áreas hipersalinas, salina e apicum, adjacentes a um manguezal do estuário do Rio Vaza-Barris (SE). Elas foram processadas por plaqueamento direto e cultura de enriquecimento em meio líquido contendo lignina Kraft como única fonte de carbono, sob diferentes concentrações de NaCl (0%, 4,5% e 11%). Foram obtidos 88 microrganismos, incluindo 35 fungos filamentosos, dos quais 32 foram identificados taxonomicamente por meio das regiões ITS, β-tubulina e calmodulina, abrangendo 16 gêneros distintos. Os isolados foram avaliados quanto ao crescimento em ligninas industriais (Kraft e organosolv) e em monômeros fenólicos, com e sem adição de NaCl. Também foi realizado um screening para atividade de lacase, e os isolados com melhor desempenho foram selecionados para análises cromatográficas (UPLC-PDA) e de produção de fitohormônios, derivados metilados de AIA, e do regulador de defesas de plantas ácido salicílico (UPLC-MS). Alguns isolados apresentatram resultados positivos quanto à produção desses compostos. Os resultados destacam a capacidade desses fungos em desconstruir lignina e gerar produtos para aplicações biotecnológicas em indústrias e na agricultura

Klebsiella pneumoniae é considerada um dos patógenos mais importantes causadores de infecções entre indivíduos imunocomprometidos. Apesar dessa associação frequente a infecções oportunistas, existem linhagens de K. pneumoniae hipervirulentas (hvKp) associadas a um fenótipo de produção de cápsula hipermucoide e que é capaz de causar infecções agressivas e metastáticas em indivíduos que não apresentam imunocomprometimento. Isso se deve ao fato dessas variantes possuírem uma grande quantidade de fatores de virulência que atuam estrategicamente as capacitando de se multiplicar e de se proteger do sistema imune do hospedeiro. Dentre esses fatores de virulência a cápsula apresenta papel protagonista com estudos mostrando que o metabolismo de diferentes açúcares está intimamente ligado à expressão da cápsula e de outros fatores de patogenicidade em linhagens hvKp. Portanto, nesse trabalho, tivemos por objetivo identificar o papel da utilização de açúcares por linhagens hipervirulentas de K. pneumoniae na expressão de fatores de virulência. Para isso, avaliamos o fitness bacteriano; a produção de biofilme e sideróforos; a capacidade de sobrevivência em soro humano e a expressão de fatores de virulência na presença de diversas fontes de carbono. Foram utilizadas três linhagens de K. pneumoniae, Kp 31 isolada de hemocultura sem fenótipo hipermucóide, Kp 34 isolada de cultura de swab retal com o fenótipo e M93, linhagem derivada de Kp 34 que teve a perda do fenótipo hipermucóide pela inserçãode TnPhoA no gene da fucose isomerase. Com esse estudo, verificou-se que a manose é um açúcar em que as linhagens apresentam um melhor fitness bacteriano e produção de biofilme, embora os isolados apresentem capacidades diferentes de produzir biofilme. As três linhagens apresentam grande produção de sideróforos e o isolado de hemocultura foi o único capaz de sobreviver em soro. Quanto a expressão de fímbrias mrkA observou-se uma expressão mais elevada nas linhagens cultivadas em glicose e manose. O gene fucI, relacionado a expressão de hipermucoviscosidade em linhagens hvKp, não foi expresso pela linhagem Kp 31 e também não foi expresso em glicose.

Ao longo dos anos desastres com petróleo têm causado poluições e toxicidade aos ambientes marinhos e terrestres. Tendo em vista estes derramamentos, faz-se necessário reduzir os danos ambientais por meio de técnicas sustentáveis e ecologicamente corretas. Posto isto, a biorremediação pode ser grande aliada neste processo, uma vez que utiliza microrganismos, especialmente bactérias e fungos para degradar as longas cadeias de hidrocarbonetos desses poluentes. Os fungos dispõem de diversas enzimas extra e intracelulares para metabolizar compostos químicos pesados, quando expostos a ambientes estressantes. Os objetivos do presente trabalho visam bioprospectar fungos filamentosos do bioma Cerrado, e observar o seu crescimento em petróleo (PT) e óleo diesel (OD), seguindo-se pelas análises do secretoma. Foram testados 6 fungos, dentre os resultados de bioprospecção, observamos satisfatório crescimento de Paecilomyces formosus (CZJ1), Clonostachys byssicola (CZJ2) e Aspergillus brasiliensis (CZJ3) em meios sólido e líquido. A partir desses resultados, os cultivos desses três fungos filamentosos foram direcionados para análise das proteínas e enzimas secretadas. Além disso, verificou-se a biodegradação dos hidrocarbonetos por meio do indicador redox 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Os resultados demostraram concentrações de proteínas totais em diesel de 23,14 µg/mL (P. formosus), 55,05 µg/mL (C.byssicola) e 183,61 µg/mL (A. brasiliensis), e no cultivo com petróleo de 62,09 µg/mL (P. formosus), 38,76 µg/mL (C.byssicola) e 51,70 µg/mL (A. brasiliensis). Assim como, constatou-se a atividade enzimática de manganês-peroxidase (MnP), na qual, C. byssicola apresentou 29,93 (U/mL) em cultivo com diesel, P. formosus e A. brasiliensis apresentaram 8,93 (U/mL) e 15,24 (U/mL) no cultivo com petróleo, respectivamente. Os resultados com DCPIP demonstraram descoloração total do corante em cultivo com diesel para P. formosus, C. byssicola e A. brasilienses e um clareamento parcial da coloração azul para P. formosus e A. brasiliensis cultivados em petróleo, indicando biodegradação dos hidrocarbonetos presentes em ambos os óleos. Nota-se o potencial dos fungos citados para processos biorremediativos, uma vez que se constata a capacidade destes em utilizarem hidrocarbonetos presentes nas substâncias citadas como fonte de carbono e metabolizá-las para o benefício do seu ciclo de vida.

A crescente demanda global por recursos renováveis é impulsionada pela escassez de matérias-primas de origem fóssil. Uma alternativa promissora é a biomassa vegetal, especialmente quando derivada de resíduos agroindustriais. Os carboidratos presentes na composição da biomassa vegetal podem ser utilizados como matéria-prima em processos de fermentação, visando a produção de compostos químicos por microrganismos. Além disso, a transição da economia linear para a economia circular é essencial para mitigar as crescentes ameaças ambientais e de saúde pública decorrentes do aumento da produção de resíduos e do esgotamento dos recursos naturais. Com diversas aplicações industriais, o etileno glicol (EG), um composto orgânico de 2-carbonos, desempenha um papel fundamental como matériaprima na fabricação de tereftalato de polietileno (PET), fluidos anticongelantes, solventes, polímeros e resinas. Em estudos anteriores, nosso grupo de pesquisa desenvolveu uma linhagem recombinante de K. phaffii capaz de produzir EG a partir de xilose por meio de uma nova rota biossintética baseada na via de Dahms. A via é composta pelas enzimas XDH (xilose desidrogenase), XD (xilonato desidratase), ALDO (dehidro-deoxi xilonato aldolase) e ALDR (aldeído redutase). Entretanto observou-se que essa linhagem também foi capaz de oxidar glicolaldeído á Ácido glicólico (AG) por meio de uma aldeído desidrogenase (ALDH) endógena. Com base nessas descobertas 6 genes putavidos para ALDR e ALDH foram selecionados e usados para construção de módulos de deleção baseados na toxina mazF de Escherichia coli. Posteriormente esses módulos foram usados para deletar os genes alvo no genoma de K. phaffii e nesse processo foi obtida uma linhagem recombinante com a deleção de um dos genes confirmada. Além disso, uma série de fermentações em biorreator de bancada foi conduzida, explorando diferentes condições de pH e pO2 (pressão parcial de oxigênio) a fim de determinar as melhores condições para a produção de EG.

A lignina é o polímero aromático mais abundante na natureza. Encontrada na parede celular das plantas, é considerado um subproduto industrial da produção de celulose a partir da madeira. Por conta de sua alta recalcitrância a sua desconstrução se torna um desafio, assim a lignina é muitas vezes descartada pela dificuldade em utilizá-la para gerar produtos de alto valor. Entretanto, atualmente mesmo com essas dificuldades, algumas indústrias são capazes de produzir materiais de interesse econômico, como os elastômeros, resinas fenólicas, termoplásticos, cosméticos entre outros. Isso mostra a capacidade versátil da lignina para ser utilizada em diferentes áreas industriais, apesar da sua dificuldade de desconstrução. Mesmo assim, ainda é preciso entender melhor como desconstruir essa macromolécula, visando gerar produtos de alto valor agregado em um processo industrial rentável, sendo que uma forma de desconstruir a lignina é a desconstrução biológica, processo que ocorre naturalmente no meio ambiente. Microrganismos na natureza, possuem a biomaquinaria necessária para clivar a lignina, sendo os fungos os principais responsáveis por esse bioprocesso. Porém, estudos recentes demonstram que as bactérias também possuem essa capacidade, mas foram menos exploradas. Este trabalho tem como objetivo o estudo sobre o uso de bactérias envolvidos na desconstrução da lignina. Desta forma, amostras de solo do Cerrado brasileiro, de ambientes propícios a degradação de lignina, foram coletadas e inoculadas no meio mínimo M9 com lignina Kraft alcalina (Sigma Aldrich, 4710030) como única fonte de carbono e incubadas a 37 °C, sendo está uma cultura de enriquecimento para seleção de microrganismos capazes de utilizar lignina. A partir da etapa de triagem foram isoladas 81 bactérias, mostrando o grande potencial pouco explorado das bactérias para desconstruir a lignina. Para assegurar a pureza das bactérias isoladas, elas foram inoculadas em colônias únicas em meios frescos por pelo menos três passagens. Para diminuir a quantidade de microrganismos repetidos na colação, somente microrganismos que apresentavam aspectos diferentes uns dos outros, como coloração, opacidade, formato das colônias e tamanho, foram selecionadas e estocadas na coleção. Todas as bactérias foram armazenadas com glicerol 20 %. As bactérias foram então testadas para sua capacidade de crescer em diferentes tipos de ligninas industriais, onde 50 delas conseguiram crescer nos três tipos de lignina testadas, a lignina Kraft Sigma, lignina Kraft industrial e na lignina organosolv industrial. 11 delas cresceram apenas na lignina kraft sigma e kraft industrial e 15 cresceram apenas na kraft Sigma e na organosolv industrial. O DNA dos microrganismos foi extraído pelo método fenol/clorofórmio e utilizado para amplificação por PCR das regiões 16S rDNA das bactérias para que fosse realizado um estudo taxonômico. O DNA de todas as bactérias foi extraído com sucesso, 46 delas tiveram seu rDNA 16S amplificado e 35 foram sequenciados e identificados. O número de bactérias isoladas mostra o potencial desse tipo de microrganismo na desconstrução da lignina. Sendo que a capacidade delas de crescerem em diferentes tipos de lignina é interessante, pois existem poucas bactérias reportadas com capacidade de crescimento em ligninas industriais, porque essas possuem impurezas que podem dificultar o crescimento dos microrganismos. Nosso estudo contribui para o entendimento da utilização desses organismos que estão diretamente envolvidos no reaproveitamento da lignina. Assim, nosso grupo pretende ainda analisar os produtos gerados, buscando identificar produtos que tenham alto valor agregado ou grande demanda comercial para futuramente utilizar o bioprocesso na indústria.

O ácido glicólico (AG) é um ácido orgânico de dois carbonos produzido pela indústria petroquímica e largamente comercializado como cosmético para esfoliação da pele e rejuvenescimento. Além disso, é empregado na indústria têxtil para curtir e pigmentar tecidos, na indústria alimentícia como conservante e acidulante, e na fabricação de polímeros de relevância médica, como o poli(ácido glicólico) e o poli(ácido lático-co-ácido glicólico). Atualmente, a produção do AG se dá por via química a partir de derivados do petróleo, o que gera impactos negativos ao meio ambiente e ao ser humano. Dessa maneira, o uso de biomassa lignocelulósica como substrato para a produção de AG em processos biológicos se apresenta como alternativa sustentável à rota química. Nesse contexto, foi construída pelo nosso grupo de pesquisa uma linhagem de K. phaffii com capacidade de conversão de xilose a etilenoglicol (EG) e a AG por meio da introdução da via heteróloga de Dahms. Na levedura recombinante, foi constatado que a última etapa da via sintética, a conversão de glicolaldeído a AG ou EG, era realizada respectivamente por aldeído redutases (ALDR) e aldeído desidrogenases (ALDH) nativas da levedura. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo a otimização do processo de produção de AG por meio da caracterização dos genes envolvidos na última etapa da via, que poderão ser deletados e superexpressos, de acordo com sua função, na levedura que expressa a via de Dahms para obter maior produção de AG. Para isso, cinco genes putativos de ALDR’s e ALDH’s foram selecionados com base na similaridade de sequência a genes de referência para serem avaliados quanto à sua atividade sobre glicoaldeído. Foram construídos cassetes de deleção para três desses genes. Além disso, para a otimização dos parâmetros do processo de produção de AG, a linhagem de K. phaffii que expressa a via completa de produção de EG e AG foi cultivada em biorreator em diferentes condições de pH e DO (oxigênio dissolvido), de acordo com um delineamento central composto rotacional (DCCR). A partir do DCCR, foi possível determinar que existe influência do pH e do DO para a produção de AG pela K. phaffii engenheirada. Por fim, a levedura engenheirada foi cultivada em biorreator com hidrolisado de biomassa como meio de alimentação para validar a produção de AG a partir dessa fonte de carbono.

Neste trabalho foram estudados os microrganismos já descritos como degradadores de polietileno, os quais foram isolados a partir de resíduos plásticos encontrados em solos do Cerrado por PEIXOTO, 2018 - Comamonas sp., Delftia sp., e Stenotrophomonas sp. O presente estudo consistiu na descrição taxonômica e fenotípica de uma das bactérias, além da caracterização de uma proteína isolada de Delftia sp. Com base na estruturação proposta neste documento, o primeiro capítulo apresenta uma introdução, no qual se justifica a escolha do microrganismo para caracterização taxonômica, para tanto utilizou-se as ferramentas ANI e dDDH, e a seleção da enzima definida para caracterização funcional selecionada a partir de dados genômico e transcritômicos do microrganismo cultivado com polietileno. O segundo capítulo, por sua vez, descreve a caracterização taxonômica da linhagem Comamonas sp. PE 63. A classificação taxonômica baseada na análise do genoma confirmou o potencial de essa estirpe consistir em uma nova espécie dentro do seu gênero, apresentando como vizinho filogenético mais próximo a C. testosteroni ATCC 11996, com dDDH de 48,6% e ANI < 93%. A análise do perfil de ácidos graxos revelou as distinções entre a PE 63 e a ATCC 11996. Além disso, foram realizadas análises comparativas de pangenoma, predição de genes e caracterização fenotípica in silico, complementando o estudo taxonômico e filogenético da Comamonas sp. PE 63. O terceiro e último capítulo descreve a caracterização bioquímica de uma peroxirredoxina produzida pelo isolado Delftia sp. PE 138. A proteína foi selecionada com base em dados de expressão diferencial durante o cultivo de Delftia sp. com polietileno como única doente de carbono. Para tanto, realizou-se a expressão heteróloga e a purificação da peroxirredoxina. Os resultados bioquímicos indicaram que a proteína é estável em uma ampla faixa de temperatura (10 a 45 °C) e que o pH ótimo de atividade é 7. Além disso, a proteína apresentou estabilidade durante sete dias quando incubada a 30 °C. Por meio de técnicas computacionais, a estrutura tridimensional dessa proteína foi prevista e validada. Os efeitos da temperatura, pH e tratamento com DTT e H2O2 nas estruturas secundárias da proteína foram inferidos por meio da técnica de dicroísmo circular. Os resultados obtidos nesse trabalho auxiliam no direcionamento de novas pesquisas no estudo de gestão de resíduos plásticos, visto que uma bactéria não descrita anteriormente e com potencial para degradação de plásticos foi caracterizada, bem como uma enzima com possível influência na biodegradação.

A presente tese aborda dois desafios cruciais na análise de dados genômicos: a agregação e complementação de metadados e a classificação filogenética de sequências biológicas. Para resolver o primeiro desafio, desenvolvemos o GeneConnector, uma ferramenta que agrega e complementa metadados de registros do GenBank, explorando informações compartilhadas entre diferentes sequências de um mesmo espécime. A aplicação do GeneConnector ao banco de dados GOPHY demonstrou sua eficácia na recuperação de informações valiosas sobre a origem, coleta e processamento das amostras, com ganhos de informação de até 60%. Adicionalmente, introduzimos os scores Observed Completeness Score - OCS e Reachable Completeness Score - RCS para avaliar a completude dos metadados e o potencial de enriquecimento de informações. Para o segundo desafio, desenvolvemos o Classeq, uma ferramenta de classificação de sequências biológicas baseada em posicionamento filogenético, rápida, precisa, independente de alinhamentos múltiplos de sequências e capaz de classificar sequências de genes inteiros. Nossos testes com o Bacillus subtilis group demonstraram a alta sensibilidade e especificidade da ferramenta, classificando corretamente quase todas as sequências do grupo em seus respectivos clados. Adicionalmente, o Classeq oferece uma interface de usuário amigável e uma API para facilitar sua integração em fluxos de trabalho existentes. Em suma, o GeneConnector e o Classeq representam avanços significativos na análise de dados genômicos, com potencial para impulsionar pesquisas em diversas áreas. Ao abordar os desafios de agregação de metadados e classificação filogenética, essas ferramentas oferecem novas perspectivas para a interpretação e utilização de dados genômicos, abrindo caminho para descobertas e aplicações inovadoras.

Organismos halófilos crescem em ambientes com altas concentrações de sais e estão distribuídos nos três domínios da vida: Bacteria, Eukarya e Archaea. Tais ambientes incluem águas salgadas, solos, alimentos salgados fermentados e sais alimentares. A presença de procariotos halófilos em sais alimentares é comum e foi descrita em vários trabalhos científicos, no entanto, não há informações sobre sua ocorrência em sais comercializados no Brasil. Assim, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização de procariotos halófilos extremos presentes em sais alimentares, inicialmente por meio de abordagens dependentes de cultivo. Alíquotas de quatro sais comerciais foram inoculadas em dois meios de cultura para halófilos (ATCC e MGM), adicionados de 3 ou 4 M de NaCl, na busca de organismos halófilos extremos. Os resultados obtidos sugerem a presença tanto de bactérias como de archaeas nos sais analisados, uma vez que foi observado o crescimento microbiano em todos os meios analisados. Em sua grande maioria, as colônias obtidas apresentavam coloração avermelhada, típica de archaeas halófilas, enquanto a análise microscópica revelou a presença tanto de cocos como bacilos, predominantemente Gram negativos. Todas as culturas foram submetidas à extração de DNA, seguida de PCR, com iniciadores específicos para Archaea e Bacteria. Amplicons obtidos a partir de alguns dos sais foram então ligados a vetores de clonagem e transformados em células de Escherichia coli XL1-Blue. Clones recombinantes foram analisados por sequenciamento de DNA e os resultados revelam a presença de archaeas cujos genes de rRNA 16S exibem elevado grau de identidade com os respectivos genes das archaeas dos gêneros Halobacterium e Halolamina

Infecções no trato urinário (ITUs) são a causa mais frequente de infecções bacterianas em seres humanos. Estima-se que a cada ano, aproximadamente 150 milhões de pessoas são acometidas por essa patologia em todo o mundo. Responsável por 80%-90% dos casos, a enterobactéria Gram-negativa conhecida como Escherichia coli uropatogênica (Uropathogenic Escherichia coli – UPEC), é o agente causador mais comum de ITUs adquiridas na comunidade. A capacidade de UPEC em sobreviver no trato urinário depende tanto de sua fisiologia e metabolismo quanto de seus determinantes de virulência. Recentemente, foi demonstrado que há uma ligação entre o transporte e o metabolismo de vários carboidratos e a virulência em enterobactérias. Todavia, como o papel preciso da utilização de carboidratos na expressão e regulação da virulência bacteriana ainda não foi determinado, buscamos compreender o impacto que o metabolismo de diferentes fontes de carbono tem sobre a expressão de fatores de aptidão e virulência na patogênese de UPECs resistentes à múltiplas drogas (MDR), com ênfase na expressão das fímbrias tipo 1. O objetivo deste trabalho é compreender o efeito que o uso de diferentes fontes de carbono tem sobre a expressão de genes e mecanismos de virulência de linhagens UPECs MDR. Para este fim, quatro linhagens diferentes de UPECs MDR (representantes do grupo A, B1, B2 e D) foram submetidas a determinação do perfil de resistência aos antibióticos, a análise da capacidade de sobrevivência e reprodução (fitness bacteriano), de expressar fímbrias tipo 1 funcionais, de formar biofilme utilizando diferentes fontes de carbono e de sobreviver em sangue e soro. Em condições anaeróbicas semelhantes a encontrada ao longo do trato urinário, todas as UPECs analisadas utilizaram D-(-)-Sorbitol como fonte de carbono de alto rendimento. Três das quatro estirpes analisadas não utilizam D-(-)-Frutose como fonte de carbono para seu crescimento. Os dados obtidos através do Ensaio de Aglutinação de Levedura sugerem que o metabolismo de D-(-)-Frutose tem relação com a expressão de fímbrias tipo 1 funcionais na superfície celular de três das quatro estirpes analisadas. UPEC 76 não utilizou D-(-)-Frutose como fonte de carbono para seu crescimento ou para expressar fímbrias tipo 1 funcionais. Todas as UPECs analisadas são classificadas como produtoras moderadas de biofilme quando crescidas em N-acetil-D-glicosamina. Três das quatro estirpes apresentaram uma capacidade aumentada de sobreviver em sangue e soro ao utilizar N-acetil-D-glicosamina como fonte única de carbono. Em conjunto, nossos dados sugerem que o metabolismo de diferentes fontes de carbono (açúcares) modulam a expressão de fatores de virulência como o crescimento exarcebado, a expressão de fímbrias tipo 1 funcionais e a resistência ao soro em diferentes estirpes de Escherichia coli uropatogênica resistentes à múltiplas drogas de origem clínica.

Corynebacterium glutamicum é uma bactéria não patogênica amplamente utilizada na produção industrial de aminoácidos, moléculas que se encontram em terceiro lugar no mundo entre as mais produzidas por meio da fermentação, atingindo milhões de toneladas e com números crescentes no mercado mundial. C. glutamicum tem sido amplamente estudada, uma vez que os métodos tradicionais utilizados para produção de aminoácidos demandam um alto custo com isso, alternativas estão sendo buscadas a fim de baratear a produção e aumentar a produtividade. Nesse contexto, a proteômica tem desenvolvido papel fundamental para compreender e melhorar a eficiência de produção de aminoácidos, visto que o entendimento das vias de biossíntese depende da interpretação de análises proteômicas. Isso porque com a proteômica existe possibilidade de descrição e caracterização do funcionamento das vias metabólicas, sendo capaz de identificar modificações pós-traducionais (PTMs), além de ser apta para identificar a degradação de proteínas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral identificar e caracterizar proteínas e complexos proteicos que participam das vias da biossíntese de aminoácidos dessa bactéria, com a influência de Tween 40 para produção de glutamato, por meio da abordagem proteômica de espectrometria de massas bottom-up, analisando o perfil proteico intracelular e extracelular. A análise de aminoácidos secretados pelo microrganismo resultou, no tempo de 18h de cultivo, a concentração de glutamato de 0,70 ± 0,14 mM na condição tween 40, enquanto na condição controle foi de 0,04 ± 0,02 mM (Teste t p<0,05). Os complexos proteicos foram separados via eletroforese BN-PAGE, apresentando complexos proteicos intracelulares variando entre 20kDa e 720kDa. Foram identificadas proteínas importantes para o metabolismo da C. glutamicum , como a enolase e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase , pertencentes a via glicolítica e a glutamina-sintetase, envolvida na biossíntese de glutamato. A análise do perfil proteico extracelular por SDS-PAGE apresentou proteínas entre 10 a 80 kDa, sugerindo diferença na abundância de algumas proteínas entre as condições. Na análise, bottom-up por LCMS/MS do secretoma, foi possível identificar algumas protéinas reguladas mais abundantes na condição com tween 40, como 2-oxoglutarato desidrogenase que é precursor da síntese de L-Glutamato. Tais resultados possibilitam a melhor compreensão do maquinário bioquímico envolvido na produção e secreção de aminoácidos por Corynebacterium glutamicum e, ajudar no aperfeiçoamento da sua manipulação científica em direção aos interesses biotecnológicos.

A demanda global de energia e a preocupação com o desenvolvimento de uma economia sustentável têm incitado a busca por processos para a obtenção de compostos químicos com potencial para substituir, ao menos em parte, os oriundos de fontes fósseis não renováveis. Nesse contexto, a biomassa lignocelulósica apresenta grande potencial como matéria-prima alternativa e renovável para a produção de compostos de alto valor agregado através de bioprocessos. Um dos principais desafios nesses processos refere-se à presença de inibidores no hidrolisado lignocelulósico, os quais são formados ou liberados durante as etapas de pré-tratamento e hidrólise da biomassa. São compostos que podem inibir o metabolismo microbiano e, consequentemente, o rendimento e produtividade dos bioprocessos. Os inibidores estão reunidos em 3 grupos principais: ácidos orgânicos (p. ex. ácidos acético, fórmico e levulínico), furaldeídos (furfural e 5- hidroximetil-2-furaldeído) e compostos fenólicos. Estudos anteriores demonstram o potencial da levedura Komagataella phaffii de manter-se ativa na presença desses inibidores. Assim, análises fisiológicas e transcriptômicas de K. phaffii revelaram genes com potencial para aumentar a tolerância da levedura a furaldeídos, ácido acético e hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar. Esse trabalho objetiva a validação da expressão de cinco genes putativos - YJR096W, YDL124W, SAP30, FLR1 e 2661 – na resposta de K. phaffii M12 na presença de diferentes inibidores, em diferentes condições de cultivos fermentativos. Inicialmente, cada um dos genes foi amplificado por PCR e clonado no vetor de clonagem pGEM®-T Easy. Para clonagem no vetor de expressão pKLD, sob controle do promotor PGK1, empregou-se os sítios de clonagem BamHI/NotI e BcuI. Até então, linhagens de K. phaffii expressando o gene YJR096W foram construídas com sucesso. Ensaios em microplaca e frasco Erlenmeyer foram realizados para avaliar as respostas da linhagem recombinante aos inibidores furfural, HMF e hidrolisado lignocelulósico. A linhagem controle e a recombinante demonstraram os mesmos perfis de crescimento, consumo de substrato e formação de produtos na presença de HMF 2 g/L, furfural 3 g/L e hidrolisado lignocelulósico 30%. Assim, nas condições de cultivo avaliadas até então, a superexpressão do gene YJR096W, em K. phaffii M12, não resultou em aumento de tolerância à presença dos inibidores furfural, HMF e hidrolisado lignocelulósico. As próximas etapas envolvem a superexpressão dos demais genes e validação das linhagens recombinantes.

A resistência antimicrobiana (RAM) acontece quando bactérias não respondem às terapias ofertadas tornando as infecções mais difíceis de serem tratadas podendo levar à morte do paciente. Serratia marcescens é uma enterobactéria responsável por causar infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) e, frequentemente, apresentam RAM. Esta espécie é considerada um agente causador de infecções oportunistas de tratamentos desafiadores devido à presença de vários tipos de mecanismos promotores de RAM. Neste contexto, é fundamental que se amplie o estudo dos mecanismos de disseminação de RAM visando o diagnóstico rápido e preciso, além do rastreamento epidemiológico para interromper a cadeia de transmissão de RAM dentro do ambiente. No presente trabalho, Quatro (4) isolados de Serratia marcescens causadores de bacteremia em pacientes internos em uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI) foram submetidos à determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana e de epidemiologia molecular. A determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana foi determinada por testes fenotípicos (antibiograma por métodos automatizados, disco difusão e imunocromatografia), genotípico para a detecção de beta-lactamases (PCR) e por genômica (sequenciamento WGS). O delineamento da cadeia de transmissão dos isolados foi determinado por epidemiologia molecular através da análise de fingerprinting de sequencias repetitivas intergênicas para enterobactérias (ERIC-PCR) e por pangenoma. As análises fenotípicas e de genômica para não susceptibilidade demonstram que todos os isolados se apresentaram resistentes a todos antimicrobianos disponíveis sendo classificados como pan-resistentes (PDR). A imunocromatografia identificou as carbapenemases KPC e NDM em todos os isolados, contudo a genotipagem por PCR identificou KPC apenas em 2 isolados e a genômica não identificou a enzima em nenhum deles. As análises de similaridade genética por ERIC-PCR e pangenomica determinou que os isolados se apresentaram filogeneticamente idênticos e, portanto, clonais. Em sua totalidade os resultados indicam que análises genômicas por WGS são ferramentas precisas e robustas para o diagnóstico de RAM, contudo a mesma deve ser realizada imediatamente após o isolamento bacteriano para evitar diagnósticos imprecisos devido a perdas de elementos genéticos instáveis, como no caso de blaKPC que codifica a enzima KPC. A análise de pan-genoma, também, demonstrou-se precisa para a identificação de clones bacterianos entre os isolados, além de possibilitar identificar a presença de clones de disseminação mundial.

O estudo de virus é de extrema importância para a sociedade, pois compreende o estudo organismos responsáveis por causar inúmeras doenças. O monitoramento regular de vírus isolados de culturas é muito importante com relação a virologia de plantas. A identificação rápida e precisa de vírus potencialmente perigosos pode prevenir surtos graves em culturas de importância econômica. Atualmente, as tecnologias de High Throughput Sequencing (HTS) tornaram-se uma ferramenta acessível e poderosa para essa finalidade. Neste estudo, avaliamos o uso de amostras de águas residuais para monitorar vírus de plantas usando análise HTS e RT-qPCR. Vírus de plantas pertencentes a 12 famílias de vírus foram encontrados, dos quais Virgaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Closteroviridae e Secoviridae foram os mais abundantes com mais de 20 espécies. Além disso, um virus quarentenário e uma nova espécie de tobamovírus também foram descobertos. Também foi analisada a relevancia de alimentos processados como fonte desses virus em águas residuais. O Pepper tobamo mild mottle virus (PMMoV) foi detectada em abundância em amostras de alimentos processados à base de pimenta e amostras de esgoto, e o Common garlic latent carlavirus (GarCLV) foi detectado em menor quantidade em amostras de alho seco e fresco e amostras de esgoto. Isso mostrou uma alta correlação entre a abundância viral no esgoto e nas fontes de alimentos processados. O uso potencial de águas residuais para pesquisa de vírus é discutido neste estudo. Além do monitoramento de virus, também é de grande importância o estudo de virus já conhecidos que também podem ter importância econômica não apenas no quesito fitossanitário, mas também tecnológico como o uso de vetores de expressão. O pepper ringpot virus (PepRSV) até o momento é o único tobravírus relatado no Brasil. Ele vem sendo usado como vetor viral para produção de proteínas recombinantes. Porém, por ser um virus restrito ao Brasil, ainda é um virus pouco estudado quando comparada a outras espécies também utilizadas para este fim. Este trabalho também apresenta como objetivo o estudo de uma putativa nova ORF N1 do PepRSV, para isso construções mutantes da ORF N1 foram agroinfiltradas em folhas de Nicotiana benthamiana e sua localização intracelular, a partir da fusão da proteína com proteínas de florescência para serem observadas por microscópio confocal. Com as construções mutantes podemos observar sintomas distintos como a ativação de lesões locais, murcha e tombamento, antes não verificados nos clones infecciosos originais. ORFN1/GFP mostrou localização associada ao reticulo endoplasmático.

A biomassa lignocelulósica é a matéria-prima renovável mais abundante no planeta e o seu máximo aproveitamento é fundamental para uma economia mais sustentável. Entre os desafios da sua utilização por microrganismos, estão a eficiente assimilação dos açúcares que a compõem e a tolerância desses organismos aos compostos inibitórios derivados das etapas de pré-tratamento e hidrólise da lignocelulose. Entre eles, o ácido acético é o principal ácido liberado durante a despolimerização da lignocelulose e exerce forte efeito inibitório ao crescimento microbiano, consequentemente comprometendo seu metabolismo e a produção de compostos de interesse. O fator de transcrição Haa1 previamente descrito em Saccharomyces cerevisiae é o principal regulador da resposta celular ao estresse fisiológico causado pela presença de ácido acético e a sua superexpressão apresenta potencial para favorecer o desempenho de outras leveduras na presença desse inibidor. Neste trabalho, o desempenho de linhagens recombinantes de Komagataella phaffii superexpressando o fator de transcrição Haa1 homólogo foi avaliado na presença de ácido acético e hidrolisado lignocelulósico. Adicionalmente, também foi avaliado o efeito da superexpressão de Haa1 sobre a produção de ácido xilônico por K. phaffii. A superexpressão de Haa1 conferiu à levedura maior tolerância ao ácido acético entre 4 g·L-1 e 6 g·L-1 reduzindo o tempo de destoxificação em até 12 horas e aumentando a produção de biomassa da levedura em até 37%. O efeito da superexpressão de Haa1 não demostrou, no entanto, efeito significativo na produção de ácido xilônico por K. phaffii quando essa foi cultivada em batelada alimentada com glicose e xilose. Os resultados obtidos demonstram a eficiência de Haa1 no aumento da tolerância a ácido acético e abrem caminho para melhorar o desempenho da levedura na produção de ácido xilônico.