O ácido xilônico (AX) é um composto orgânico com aplicações promissoras nas indústrias farmacêutica, química e têxtil. Ele pode ser produzido a partir da oxidação da xilose, presente na fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos, pela ação da enzima xilose desidrogenase (XDH). A levedura Komagataella phaffii tem sido amplamente utilizada na produção de compostos químicos de interesse industrial. Previamente, linhagens recombinantes de K. phaffii capazes de produzir AX foram obtidas pela expressão de genes bacterianos codificadores da XDH. Embora essas linhagens apresentem bom rendimento em meio sintético, o desempenho em hidrolisado necessita ser melhorado. Este trabalho teve como objetivo estabelecer parâmetros físico químicos adequados para a produção de AX e aplicá-los em hidrolisado hemicelulósico. Para isso, foram avaliados, de forma sequencial e em ensaios independentes, cinco parâmetros: concentração inicial de xilose (20, 40, 80 e 120 g/L), pH (3,5; 4,5; 5,5 e 6,5), concentração inicial de biomassa celular (0,5; 1,5; 3,0; 5,0 e 10,0 g/L), temperatura (26, 28, 30 e 32 ºC) e nível de oxigênio dissolvido (1, 10 e 20%). Os cultivos foram conduzidos em frascos agitados e em biorreatores de bancada, com quantificação de AX e açúcares por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados indicaram melhor desempenho do processo em 40 g/L de xilose; pH 5,5; temperatura de 30 ºC, biomassa celular inicial de 5,0 g/L e oxigênio dissolvido de 10%. Nessas condições, a partir de experimento em batelada de 24 h, foi obtido 20,12  0,17 g/L de AX, taxa de consumo de xilose de 1,37  0,01 g/L.h, produtividade volumétrica de 0,84  0,01 g/L.h e rendimento de 0,61  0,01 g AX/g xilose. Com base nesses resultados, os parâmetros estabelecidos em meio sintético foram aplicados em cultivo em batelada alimentada utilizando hidrolisado de biomassa de cana-de-açúcar, alcançando 5,56  0,35 g/L de AX, produtividade volumétrica de 0,05  0,00 g/L.h e rendimento de 1,02  0,05 g/g. Embora a produtividade e concentração final de AX tenham sido inferiores às reportadas na literatura para a linhagem K. phaffii XDH-HL, o rendimento obtido foi superior ao previamente descrito em hidrolisado. Em conclusão, os resultados demonstram que a definição criteriosa de parâmetros físico-químicos constitui uma base para a aplicação do processo em hidrolisado lignocelulósico, evidenciando o potencial de aprimoramento da produção de AX por K. phaffii.

A resistência aos antimicrobianos (RAM) é um problema de saúde pública global que resulta em dificuldades no tratamento de doenças infecciosas. A RAM pode ser adquirida por meio de mutações, por transferência horizontal e também pode resultar de uma adaptação decorrente de alterações metabólicas. Essa última é associada à resistência adaptativa, que pode ser definida como um mecanismo de sobrevivência microbiana à ação dos antibióticos obtida por meio da alteração da expressão gênica e/ou proteica de forma temporária. Apesar de pouco relatada, a resistência adaptativa é de suma importância, já que o uso inadequado dos antibióticos pode servir como um estímulo e ocasionar uma mudança na expressão de genes e proteínas, resultando em linhagens resistentes à ação desses medicamentos. O objetivo deste trabalho é testar a capacidade da bactéria Escherichia coli na resposta às concentrações subinibitórias (CSI) de antibióticos e avaliar as diferenças na expressão de proteínas nessas condições. Para este fim, foram utilizadas três linhagens: um isolado clínico de urocultura (UPEC 90) e as duas linhagens padrões na literatura (CFT 073 e J96). Todas as estirpes foram cultivadas em concentrações crescentes, de 0,1 µg/mL, até atingir a Concentração Inibitória Mínima - CIM dos antibióticos: Gentamicina, Cloranfenicol e Polimixina B, a fim de se obter culturas adaptadas ao crescimento na presença de antimicrobianos em CSI. Após o estabelecimento das culturas CSI, o tempo de geração de cada uma delas foi comparado ao da linhagem original (cultivada sem antibióticos). A partir UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA - UnB INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - IB DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR - CEL dos cultivos nas diferentes concentrações de antimicrobianos, foram obtidas 40 culturas CSI. Dentre essas, 14 CSI apresentaram viabilidade em concentrações de até 4,0 µg/mL de Gentamicina; 12 em concentrações de até 0,4 µg/mL de cloranfenicol; e 14 mantiveram-se viáveis em concentrações de até 2,0 µg/mL de polimixina B. Notavelmente, 8 CSI derivadas da UPEC 90 apresentaram menor tempo de geração do que a linhagem original, sete quando cultivadas em gentamicina e uma em cloranfenicol. Então, duas CSI provenientes da UPEC 90 em Gentamicina (90 G 1,6 µg/mL e 90 G 4,0 µg/mL) foram selecionadas para avaliar a produção de biofilme e a sobrevivência na CIM da Gentamicina por 1 hora. Foram observadas diferenças significativas na produção de biofilme por essas culturas, demonstrando uma queda nos valores de biomassa quando comparadas à linhagem original. Através da contagem de unidades formadoras de colônia (UFCs), foi possível observar um comprometimento da viabilidade da colônia original, enquanto as culturas CSI tiveram um crescimento 10x maior. Por fim, para a identificação das proteínas diferencialmente expressas entre a CSI 90 G 4,0 µg/mL e a linhagem original, foi realizada uma análise no espectrômetro de massas LTQ-Orbitrap Elite. Os dados obtidos revelam 101 proteínas diferenciais, 61 apresentaram uma regulação negativa na cultura CSI e 40 tiveram regulação positiva. Os resultados sugerem diferenças na expressão de proteínas que levaram a uma viabilidade das culturas CSI mesmo após exposição à Gentamicina, através da adoção de um metabolismo anaeróbico, crescimento acelerado e produção de proteases para clivagem de proteínas truncadas ou não funcionais.

Acinetobacter baumannii é um dos principais patógenos humanos no que tange infecções nosocomiais com números expressivos de casos registrados ao redor do mundo. Em virtude desse cenário, associado à alta prevalência de fenótipos de resistência a antimicrobianos, a espécie foi classificada como crítica pela OMS e estudos acerca dos padrões de virulência e resistência são amplamente incentivados. Nesse contexto, este estudo visa o maior entendimento do resistoma de isolados obtidos de pacientes do Hospital Universitário de Brasília (HUB) e do Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF) em amostras coletadas antes e após a pandemia de COVID-19. A inclusão desses dois períodos justifica-se pelo contexto de uso indiscriminado de antimicrobianos durante a pandemia, o que contribuiu para o agravamento do cenário de resistência. As amostras coletadas no HUB no ano de 2018 foram triadas em meios seletivos, buscando identificação e confirmação dos fenótipos resistentes a múltiplas drogas. Os resultados da triagem indicam a presença de A. baumannii multirresistentes entre as amostras provenientes de pacientes do HUB coletadas em 2018. Após a avaliação inicial das amostras coletadas no ano de 2018, foram incluídas as amostras coletadas no HUB e HBDF em 2025. O conjunto de isolados foi cultivado e o DNA extraído para sequenciamento, processamento e análise dos genomas, com o propósito de investigar o resistoma dos isolados selecionados. A identificação pela plataforma TYGS indicou a presença de 10 isolados de A. baumannii. Foram anotados um total de 56 genes de resistência dentre todos os isolados, variando entre os mecanismos de resistência: bombas de efluxo, inativação de drogas, alteração dos alvos, alteração de via metabólica, redução de permeabilidade e proteção dos alvos. Os resistomas se mostraram diversos e dinâmicos, mas contendo um núcleo conservado entre todas as amostras, independente do ano de coleta. Os resultados indicaram alta sobreposição de mecanismos de resistência a múltiplas drogas, conferindo redundância à resistência para várias classes de antibióticos. As características dos resistomas indicaram a necessidade de desenvolvimento de um sistema de vigilância epidemiológica robusto para melhorar o controle da disseminação de isolados resistentes, em especial aqueles que apresentam fenótipo CRAB e MDR. Para isso, são necessários estudos complementares para ampliar a cobertura dos sequenciamentos, de forma a melhorar o entendimento dos perfis de resistência, bem como de outras características importantes da espécie bacteriana estudada. Ainda, a inclusão de um conjunto mais representativo de isolados poderá contribuir para uma caracterização mais abrangente do resistoma, bem como para a identificação de outras características relevantes da espécie bacteriana estudada.

A regulação transcricional é um componente essencial para a previsibilidade e eficiência de sistemas de expressão heteróloga e estratégias de engenharia metabólica. Em fungos basidiomicetos, entretanto, a caracterização funcional de promotores gênicos permanece incipiente, limitando o desenvolvimento de ferramentas moleculares adequadas para modulação controlada da expressão gênica. Neste contexto, este projeto tem como objetivo caracterizar promotores endógenos de Pleurotus ostreatus, estabelecendo bases moleculares e metodológicas para sua aplicação em sistemas de expressão fúngicos e, em perspectiva, para a otimização de vias metabólicas complexas. A via de biossíntese dos canabinoides é um exemplo dessa complexidade, e tem como produtos metabólitos secundários de plantas com emergente interesse. Os avanços biotecnológicos têm seguido para abordagens de produção heteróloga. De tal forma, é necessário que ferramentas de edição genética sejam investigadas, inclusive enzimas alternativas para as etapas da via, organismos de plataforma e métodos de transformação e vetorização desses organismos. Como resultados, foram identificadas e analisadas in silico regiões promotoras associadas a genes candidatos no genoma de P. ostreatus, selecionadas com base em critérios de expressão constitutiva e relevância dentro do contexto metabólico. A análise das sequências revelou arquiteturas cis-regulatórias complexas, com distribuição heterogênea de elementos clássicos de iniciação da transcrição, como TATA-box, CAAT-box e GC-box, além de múltiplos sítios putativos de ligação a fatores de transcrição. A comparação com promotores ortólogos de Saccharomyces cerevisiae evidenciou diferenças estruturais consistentes com a diversidade regulatória entre espécies, reforçando a necessidade de caracterização específica em basidiomicetos.Paralelamente, foram realizadas etapas experimentais preparatórias fundamentais para a validação funcional subsequente dos promotores. Essas etapas incluíram a padronização das condições de seleção e contrasseleção em P. ostreatus, com determinação da concentração mínima inibitória de higromicina e avaliação do uso de antibióticos para supressão de Agrobacterium tumefaciens. Adicionalmente, foi verificada a integridade estrutural do vetor pFAT-GFP por sequenciamento de longa leitura, confirmando sua adequação para ensaios de expressão gênica. Bem como, foi feita a triagem in silico de proteínas que sirvam como alternativas para enzimas que estão presentes na via dos canabinoides. Onde, parte significante foi encontrada em de P. ostreatus, ou em organismos que apresentaram estruturas homologas. Além disso, propomos a construção de uma biblioteca de engenharia genética baseada em clonagem modular para o escalonamento de transformações, a fim de otimizar a implementação da via. Em conjunto, os resultados obtidos estabelecem uma base para a caracterização funcional de promotores em Pleurotus ostreatus. As análises funcionais diretas dos promotores, incluindo ensaios com gene repórter e quantificação de expressão, constituem as próximas etapas do estudo.

A adoção de tecnologias de base renovável tem se tornado cada vez mais urgente diante dos efeitos das mudanças climáticas e dos impactos ambientais associados ao uso intensivo de recursos fósseis. Em resposta a esses desafios, cresce o interesse por soluções biotecnológicas como alternativas sustentáveis às rotas petroquímicas tradicionais, com potencial para reduzir emissões, valorizar subprodutos agroindustriais e diversificar a matriz produtiva. Nesse contexto, este trabalho consolidou estratégias para o desenvolvimento sistemático de bioprocessos, empregando duas linhagens engenheiradas da levedura Komagataella phaffii, produtoras de etilenoglicol (EG) e de 1,2,4-butanotriol (BTO), como modelos de estudo. A abordagem adotada combinou engenharia da linhagem, formulação de meios de cultivo, definição de parâmetros operacionais, análises metabólicas, cinéticas e termodinâmicas, modelagem matemática e experimentos em redução de escala, permitindo integrar resultados provenientes de diferentes perspectivas experimentais e computacionais. A avaliação da disponibilidade de oxigênio demonstrou que condições limitantes favorecem a produção de etilenoglicol e que ajustes na taxa de transferência de oxigênio podem maximizar sua formação. O modelo de compartimentos desenvolvido para um reator industrial de coluna de bolhas permitiu identificar gradientes críticos, caracterizar mecanismos limitantes e definir faixas operacionais adequadas para aplicações industriais. Experimentos de redução de escala reproduziram essas heterogeneidades, avaliando a sensibilidade da levedura às flutuações nos níveis de oxigênio e confirmando seu impacto na seletividade e no desempenho do processo. A otimização sistemática de meios de cultivo resultou na seleção e no refinamento de formulações mais eficazes, com aumentos de até 54% na produção de etilenoglicol e expressiva simplificação da composição química. A investigação de parâmetros operacionais, como as concentrações e as proporções entre os substratos, a densidade celular e o pH, permitiu identificar condições mais favoráveis à maximização da produção. Os ajustes cinéticos descreveram com precisão a coassimilação de glicose e xilose e fundamentaram o desenvolvimento de um modelo dinâmico de batelada alimentada. Esse modelo definiu estratégias de alimentação que resultaram, experimentalmente, no maior título de etilenoglicol obtido para a linhagem, de 13,5 g/L, correspondente a aproximadamente 42% da conversão teórica, mantendo a produtividade e os rendimentos previamente observados. Os resultados alcançados indicam a existência de restrições intrínsecas à via metabólica heteróloga, que limitam o aumento da conversão e da produtividade do processo. A combinação de análises de fluxo, termodinâmica e cinética permitiu identificar os principais pontos restritivos da via metabólica, em especial as enzimas xilonato desidratase e aldolase, cuja baixa eficiência catalítica e elevada demanda proteica impõem limitações ao desempenho global da via. No caso do 1,2,4-butanotriol, a avaliação dos efeitos da disponibilidade de oxigênio, do pH e da concentração celular inicial permitiu identificar a combinação de parâmetros mais favorável à maximização da produção. Sob essas condições otimizadas, a linhagem apresentou um aumento de 147% na concentração obtida em comparação à configuração inicial, atingindo 1,3 g/L. Este trabalho estabelece uma estrutura metodológica aplicável a diferentes bioprocessos, independentemente do produto de interesse ou do microrganismo utilizado. O alcance de níveis de desempenho compatíveis com operações em grande escala depende da integração entre engenharia de processos e engenharia metabólica, que devem atuar de forma complementar e interdependente para superar limitações fisiológicas, explorar o potencial das vias sintéticas e viabilizar a produção biotecnológica em escala industrial.

Os vírus constituem importantes agentes etiológicos de doenças emergentes em diversas culturas agrícolas, incluindo o tomateiro (Solanum lycopersicum). As plantas daninhas, por sua vez, exercem papel fundamental como reservatórios e hospedeiros alternativos, contribuindo para a persistência, diversidade e dispersão de vírus, especialmente aqueles que possuem genoma de DNA de fita simples (ssDNA), como os vírus dos gêneros Begomovirus, Citlodavirus, Mulcrilevirus, Badnavirus, Caulimovirus, Gemycircularvirus e Gemykolovirus. Informações sobre taxonomia características biológicas, etiologia de doenças, organização genômica, bem como transmissão e importância destes vírus e ferramentas de estudo são contempladas no Capítulo 1 desta tese. Com a crescente diversidade de espécies, o uso de ferramentas como o Sequenciamento de Alto Rendimento (High-Throughput Sequencing - HTS) tem possibilitado o estudo detalhado da diversidade viral e tem sido amplamente utilizado de forma consistente. O desenvolvimento e a evolução de novas tecnologias de HTS estão revolucionando a descoberta de vírus, o diagnóstico, os estudos metagenômicos e evolutivos. Dessa forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender o papel das plantas daninhas e associadas ao cultivo do tomateiro como reservatório de vírus de ssDNA, bem como alterações genéticas das populações. Com essa finalidade, foi realizado um levantamento da diversidade genética das populações virais, incluindo begomovírus que ocorrem em plantas daninhas e outras espécies de plantas associadas ao cultivo do tomateiro, pertencentes a 15 famílias botânicas: Asteraceae, Bignoniaceae, Brassicaceae, Cactaceae, Capparaceae, Caricaceae, Cleomaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Malvaceae, Moraceae, Poaceae, Ruscaceae e Solanaceae. Para isso, foram coletadas 114 amostras foliares com sintomas típicos de begomovírus. O DNA total das amostras foi extraído e utilizado como molde para RCA (Rolling Circle Amplification). O conjunto de amostras a partir de RCA foi preparado na forma de um pool de amostras que foi enviado para sequenciamento usando a plataforma NovaSeq6000 na Agrega. Após o sequenciamento, os dados foram analisados utilizando ferramentas de bioinformática. Como resultado proveniente do HTS foram recuperados 19.575.404 reads e 62.444 contigs. Foi possível recuperar 103 sequências virais sendo um total de 99 genomas completos e quatro genomas parciais. As sequências se distribuíram em cinco famílias distintas: Geminiviridae (85 contigs), Caulimoviridade (13 contigs), Genomoviridae (3 contigs), Alphasatellitidae (1 contig) e Circoviridade (1 contig). A família Geminiviridae foi a mais representativa, com três gêneros Begomovirus (83 contigs), Citlodavirus (1 contig), e Mulcrilevirus (1 contig). No gênero Begomovirus (família Geminiviridae) foi possível recuperar sete espécies conhecidas e cinco potenciais novas espécies denominadas: espécie nova #1 (C493), espécie nova #2 (C218), espécie nova #3 (C64), espécie nova #4 (C08) e espécie nova #5 (C329). Além disso, outra espécie nova denominada espécie nova #6 (C1998) (gênero Citlodavirus, família Geminiviridae) foi recuperada nesse pool. Análises para confirmação da hospedeira foram realizadas usando os primers ITS2F e ITS2R (Capítulo 2). Primers espécie-específicos foram empregados para recuperação dos genomas por PCR em cada amostra individualmente. Os resultados obtidos são apresentados e discutidos. A descrição e análise de 06 espécies novas encontra-se organizada por capítulo. Desta forma, informações sobre uma nova espécie, de genoma monopartido, classificada no Begomovirus foi denominada aqui de New species #5 C329 e detectada na amostra PR-134 coletada em 2012 em Capitão Leonidas Marques, Paraná, sul do Brasil. A análise filogenética mostrou que a nova espécie compartilha 84–85% de identidade com outros begomovírus, sendo a identidade filogeneticamente mais próxima de 85% com tomato severe rugose virus – ToSRV [MW596573] (Capítulo 3). No capítulo 4, quatro novas espécies de begomovírus bipartidos recuperadas em HTS, tiveram a organização genômica analisada em detalhe quanto às ORFs e motivo, e foi encontrado o DNA-B correspondente a cada uma delas. A sequência parcial foi sequenciada via Sanger. O DNA-A foi recuperada via PCR com primers espécies-específicos. Isolados das espécies novas #1 (NS#1) e #2 (NS#2) foram detectados em amostras provenientes de Goiás - GO (RGO-835 e RGO-834). Dois isolados da espécie nova #3 (NS#3) foram detectados em amostras do Pará (PR-126 e PR-136). Sete isolados da espécie nova #4 (NS#4) foram identificados em amostras provenientes de três estados brasileiros: Goiás (RGO-836, RGO-838, RGO-834 e RGO-833), Distrito Federal (RDF-826 e RDF-827) e Rio Grande do Sul (RS-082). A análise filogenética demonstrou que NS#1 tem identidade filogenética mais próxima com BGMV (MN822294); NS#2 é filogeneticamente mais próxima de Cleome leaf crumple virus (CleLCrV) (FN4359999); NS#3 é mais próxima de tomato leaf distortion virus (ToLDV) (NC_038474), e NS#4 é mais próxima de Sidastrum golden leaf spot virus – SidGLSV (NC_038462). As análises de recombinação demonstraram existe evidência de recombinação entre as novas espécies NS#3 e NS#4. No capítulo 5 informações sobre o gênero Mulcrilevirus detectado em uma amostra coletada no Distrito Federal (RDF-831) ilustram a importância de estudos HTS para conhecer a diversidade viral no país. Trata-se do primeiro registro desse vírus fora da China. A sequência C93 apresentou 92–93% de identidade (95% de cobertura da consulta) com isolados de Mulcrilevirus mori (= mulberry crinkle leaf virus – MCLV), dentre eles o isolado MN240483.1. No capítulo 6, informações da descrição de uma nova espécie do gênero Citlodavirus são apresentadas. Isolado deste gênero foi detectado em uma amostra do Mato Grosso (MT-012), coletada em 2010 em Cuiabá, na região Centro-Oeste brasileira. A análise filogenética mostrou que a espécie compartilha 72,50% de identidade com Citlodavirus passiflorae (Passion fruit chlorotic mottle virus) [NC_040706.1]. No capítulo 7 é relatada a identificação de CleLCrV em uma amostra coletada no Paraguai (PAR-005), em Major Otaño, no ano de 2010. Trata-se do primeiro registro desse vírus no Paraguai. Esse isolado apresentou de 94,33% de identidade (100% de cobertura) com o isolado de DNA-A de acesso FN435999.1. O capítulo 8 apresenta o primeiro relato de um vírus do gênero Gemycircularvirus em repolho e malva, coletadas em 2022, uma na região do Distrito Federal (DF-284) e outra no estado do Goiás (RGO-834). Esse é o primeiro registro nessas hospedeiras. O isolado apresentou 91.26% de identidade com Gemycircularvirus mocha1 (Momordica charantia associated Gemycircularvirus; NC_075310.1). No capítulo 9 relata-se a detecção de um vírus do gênero Gemykolovirus em uma amostra coletada em Urutaí, estado de Goiás, em 2022 (RGO-833). O isolado apresentou 88.44% de identidade (56% de cobertura) com um isolado do vírus Gemykolovirus heris1 (Plant associated genomovirus 7 – PaGmV 7) [NC_076273.1]. Trata-se do primeiro relato de PaGmV 7 em Digitaria catamarcensis (Poaceae). Esses resultados reforçam a importância do monitoramento contínuo de plantas daninhas e não cultivadas que crescem nas proximidades das culturas, uma vez que podem atuar como reservatórios de vírus que contribuem para sua disseminação.

As esponjas de água doce (Spongillina) apresentam ampla distribuição continental, com a maior riqueza taxonômica registrada na região Neotropical. Exclusivamente aquáticos, sésseis e filtradores, esses organismos abrigam uma comunidade simbiótica diversa que desempenha papéis ecossistêmicos e fisiológicos vitais. Neste estudo, posicionamos taxonomicamente o hospedeiro e investigamos os perfis taxonômicos e funcionais do microbioma associado à esponja de água doce Metania sp. nov., bem como características genômicas relacionadas à simbiose, utilizando uma abordagem metagenômica. Os marcadores ribossômicos ITS2-28S agruparam com sucesso a Metania sp. nov. no clado Metania, evidenciando, ao mesmo tempo, uma divergência evolutiva significativa em relação a congêneres como M. pottsi e M. reticulata. Adicionalmente, recuperamos e montamos o primeiro genoma mitocondrial completo para o gênero. A análise metagenômica revelou uma comunidade microbiana diversa associada tanto à esponja quanto à água circundante, abrangendo 17 filos dos domínios Bacteria e Archaea. As bactérias compreenderam 16 filos, com predominância de Pseudomonadota, Actinomycetota e Bacteroidota em ambos os microbiomas. O microbioma associado à Metania sp. é funcionalmente especializado, desempenhando papéis putativos na nutrição, defesa e adaptação do holobionte. A partir dos 59 genomas montados a partir de metagenomas (MAGs) recuperados, a análise de pontuação MW revelou uma 2 comunidade predominantemente heterotrófica. Especificamente, Pseudomonadota demonstrou um potencial robusto para degradar matéria orgânica dissolvida — incluindo aminoácidos, ácidos graxos e carboidratos complexos —, provavelmente sustentando a estrutura simbiótica por meio da ciclagem de nutrientes. Por fim, repetições de tetratricopeptídeo (TPR) e anquirina (ANK), representando proteínas do tipo eucariótico (ELPs), foram prevalentes em Alpha- e Gammaproteobacteria, destacando ELPs potencialmente secretadas que são cruciais para a manutenção estável da simbiose.

Os ácidos graxos de cadeia curta (Short-Chain Fatty Acids - SCFAs) são os principais metabólitos da microbiota intestinal e possuem repercussão na manutenção da homeostase sistêmica, a partir de efeitos que perpassam a modulação da expressão gênica e metabolismo celular. Seu papel nas relações patógeno-hospedeiro envolve efeitos imunomodulatórios especialmente nos fagocíticos, promovendo o equilíbrio pró- e antiinflamatório. Estudos preliminares sobre o papel dos SCFAs em infecções bacterianas e fúngicas sugerem que macrófagos possuem capacidade fungicida aumentada. Entretanto, ainda não há registros do efeito de SCFAs em Paracoccidioides brasiliensis, uma das espécies responsáveis pela Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a principal micose sistêmica no Brasil e América Latina, e cujo tratamento inclui eventos adversos, longa duração e resistência a antifúngicos, o que torna cada vez mais necessária a busca por alternativas terapêuticas para a patologia. Destarte, o objetivo da pesquisa é avaliar o potencial papel imunomodulador dos SCFAs na atividade de macrófagos infectados por leveduras de P. brasiliensis. Macrófagos murinos de linhagem imortalizada e primários foram tratados com Acetato, Propionato ou Butirato de Sódio e infectados in vitro com leveduras do isolado Pb18. A produção de citocinas e óxido nítrico (NO) foi avaliada pelos ensaios ELISA e Griess, respectivamente, por 24 e 48 horas. Adicionalmente, avaliou-se a capacidade fungicida de macrófagos e o papel da acidificação do fagolisossomo nesse processo, Como resultados, foi possível apontar inibição na secreção de TNF-α e IL-10 e aumento na secreção de IL-1β por macrófagos infectados tratados com SCFAs, em relação aos grupos não tratados. Além disso, o tratamento com SCFA promove uma aumentada capacidade fungicida dependente da acidificação do fagolisosomo. Como considerações parciais, portanto, os SCFAs mostraram inibir a secreção de citocinas pró/anti-inflamatórias na infecção de macrófagos por P. brasiliensis e, além disso, a acidificação do fagolisossomo é necessária para a atividade fungicida induzida por SCFAs. Os achados, portanto, sugerem um papel imunomodulador dos SCFAs nesses fagócitos.

A enzima L-asparaginase é utilizada no tratamento da Leucemia Linfoblástica aguda (LLA) no Brasil e no Mundo. No Brasil, já se tem um protocolo de tratamento desenvolvido pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA) de 2001, utilizando L -asparaginases de origem bacteriana, principalmente de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi. No entanto, as enzimas de origem procariótica apresentam reações adversas e toxicidade, que podem levar à suspensão de sua utilização no tratamento de LLA em alguns pacientes. Desta forma, ainda existe a demanda por fontes alternativas de L-asparaginases tão eficientes quanto às já comercializadas, mas que apresentem menos reações adversas e toxicidade, assim como, sejam produzidas com maior rendimento. Ainda considerando o cenário no Brasil, o SUS apresenta dificuldade no seu abastecimento uma vez que esta enzima é importada. Neste cenário, a presente proposta de pesquisa teve como meta central a obtenção de enzimas de origem eucariótica, fungos filamentosos P. sizovae e F. proliferatum, por expressão heteróloga para avaliar a sua utilização no desenvolvimento de formulação estável para tratamento de LLA com menos reações adversas e toxicidade e em processo nacional que possa levar à sua produção em larga escala. As sequências dos genes de asparaginases de P. sizovae e F.proliferatum foram obtidos em trabalho anterior, sintetizados e clonados no vetor pET28A pela empresa genone. No presente trabalho, os genes foram subclonados nos vetores da série pSFOXB (pSFOXB1, 11 e 15) , para avaliar a viabilidade de processo de produção por expressão constitutiva em oposição ao indutivo (pET28A). Foram obtidos clones transformantes para cada uma das construções que estão sendo analisados quanto à presença do inserto e posteriormente, serão analisados quanto à produção da proteína de interesse, presença e atividade. Uma vez obtidas as asparaginases heterólogas estas serão avaliadas na formulação de um fármaco à base de Lasparaginase, meta do projeto no qual a presente proposta de pesquisa está inserida. Dentre estas análises serão realizados estudos de toxicidade e melhoramento de fármacos através de modificações químicas ou moleculares no produto original, visando redução da toxicidade do produto final, redução da imunogenicidade e alterar sua farmacocinética e a farmacodinâmica. 

Os efeitos de longo prazo da adição de nutrientes sobre as comunidades microbianas do solo estão sendo investigados em uma área de Cerrado sensu stricto, localizada na Reserva Ecológica do IBGE (RECOR/IBGE). O experimento contempla cinco tratamentos distintos: controle (sem adição de nutrientes), cálcio (Ca), nitrogênio (N), nitrogênio + fósforo (NP) e fósforo (P). O objetivo do estudo é compreender de que forma a adição contínua de diferentes nutrientes altera os atributos físico-químicos e biológicos do solo. Diversas abordagens foram utilizadas para essa avaliação. A qualidade nutricional do solo foi analisada por meio da determinação de macro e micronutrientes e da atividade de enzimas-chave dos ciclos do carbono, fósforo e enxofre (beta-glicosidase, fosfatase ácida e arilsulfatase). A qualidade geral do solo foi estimada utilizando o índice BioAS, integrando dados físicos, químicos e biológicos. A estrutura e diversidade das comunidades microbianas foram avaliadas por meio de metagenômica, com foco na abundância relativa de fungos e bactérias. Os resultados revelaram que todos os tratamentos com adição de nutrientes promoveram alterações significativas no solo em comparação ao controle. A calagem (Ca) foi o tratamento que apresentou os efeitos mais abrangentes, principalmente na melhoria da disponibilidade de nutrientes, aumento da atividade enzimática e favorecimento de comunidades microbianas benéficas. No entanto, os tratamentos com nitrogênio (N), fósforo (P) e a combinação NP também demonstraram impactos importantes, particularmente sobre a composição e diversidade das comunidades microbianas, além de respostas específicas em parâmetros bioquímicos do solo. Esses resultados indicam que, embora a calagem seja fundamental para a correção da acidez e melhoria geral da qualidade do solo, a adição de N e P contribui de forma complementar, promovendo mudanças na estrutura e função microbiana que refletem diretamente na sustentabilidade e funcionamento ecológico do solo do Cerrado.

O Brasil destaca-se no cenário mundial do agronegócio por possuir o maior rebanho comercial, predominante criado em regime de pastagem. Aproximadamente 90% dessas áreas são ocupadas por Brachiaria brizantha cv. Marandu, sendo a alimentação bovina baseada na digestão da parede celular dessa gramínea. A desconstrução da biomassa lignocelulósica representa um desafio para a nutrição de ruminantes, exigindo o uso de coquetéis enzimáticos capazes de atuar de forma sinérgica sobre as diferentes frações estruturais. No Brasil, as enzimas atualmente utilizadas com essa finalidade são importadas, o que eleva o custo da aplicação, criando uma oportunidade para o desenvolvimento de formulações a partir da diversidade microbiana nacional. Neste estudo, foram prospectados, caracterizados e avaliados microrganismos e enzimas com potencial aplicação como aditivos zootécnicos. Entre os isolados avaliados, o Fusarium oxysporum isolado 79(11A) destacou-se pela elevada eficiência na degradação da B. brizantha, sendo selecionado para ensaios otimizados. Os ensaios de produção enzimática evidenciaram que a suplementação do meio de cultivo influenciou de forma distinta cada atividade, sendo o quinto dia de cultivo em meio suplementado com farelo de trigo e glicerol a condição que levou à maior produção de atividades de celulase total e endoglicanases. O tratamento hidrotérmico da biomassa favoreceu a ação das celulases, enquanto a atividade de xilanase foi superior em biomassa in natura, superando inclusive o desempenho de uma enzima comercial. O extrato enzimático obtido a partir de biomassa pré-tratada apresentou desempenho e estabilidade hidrolítica próximos ao de uma enzima comercial e sua concentração por liofilização elevou significativamente as atividades enzimáticas, especialmente de endoglicanase. Na etapa de expressão heteróloga, a celobiohidrolase H01-08 reagiu positivamente no teste com MUC, teve sua inserção confirmada no vetor pET-21a(+), e apresentou relação filogenética com famílias GH5 e GH6, compartilhando parcialmente os domínios conservados da GH5. Entretanto, não foram detectadas atividades hidrolíticas em substratos sintéticos, possivelmente devido a limitações na secreção da enzima. Os resultados obtidos demonstraram o potencial do isolado 79(11A) como fonte de enzimas lignocelulolíticas e indicam estratégias para melhoria dos sistemas de expressão heteróloga, visando a formulação de coquetéis enzimáticos mais eficientes para aplicação na alimentação de ruminantes. 

A Canola (Brassica Napus) é uma cultura que possui um mercado com alto potencial de expansão principalmente por conta da possibilidade de produção de biocombustíveis. A cultura absorve grande quantidade de nutrientes e necessita que seja fornecida a quantidade adequada para melhor produção de grãos. O potássio é um nutriente altamente demandado pela maioria das culturas e o sucesso e qualidade na produção exigem que este esteja disponível da maneira adequada para as plantas. Fertilizantes potássicos empregados no Brasil são em sua grande maioria importados. Dessa forma, visando diminuir essa dependência do país, o uso de rochas, que caracteriza prática mais sustentável, vem sendo estudado a fim de diminuir custos de produção e impactos ambientais. As rochas silicáticas possuem teor considerável desse nutriente em sua composição que promove o suprimento de K. Contudo a forma como o K encontra- se disponível não condiz com a velocidade agrícola e suas necessidades. O fósforo (P) é um elemento essencial para as plantas e por se tratar de um nutriente que apresenta forte interação com o solo (fixação) sua falta acaba sendo limitante para a produção. O uso de microrganismos surge como uma proposta biotecnológica relevante para acelerar a solubilização desses nutrientes no solo. Além disso, microrganismos podem interagir positivamente com plantas, produzindo fitormônios que estimulam o crescimento vegetal. Diante disso, este trabalho tem como objetivo identificar linhagens de leveduras que atuem como bioestimulantes que são produtos que contêm substâncias naturais com diferentes composições, concentrações e proporções, que pode ser aplicado diretamente nas plantas, nas sementes e no solo, com a finalidade de incrementar a produção. Para alcançar esse objetivo, ensaios de solubilização de quatro diferentes fontes de K (ekosil, potasil, siltito e micaxisto) e de P (fosfato tricálcio) e capacidade de produção de fitormônios serão realizados com 72 leveduras. A condução de bioensaio de solubilização de K e P em condições laboratoriais permitiu a identificação de 26 linhagens com características quanto à solubilização e produção de ácido indolacético. Posteriormente, 8 linhagens serão avaliadas pela capacidade de promover o crescimento da canola em casa de vegetação.

Klebsiella spp. é um dos gêneros da família Enterobacteriaceae mais associados a infecções nosocomiais e adquiridas na comunidade. Dentro do gênero, as espécies Klebsiella pneumoniae e Klebsiella variicola são geneticamente próximas e podem causar infecções do trato urinário (ITUs), pulmonares, sanguíneas e septicemias. Além da patogenicidade inerente a ambas as espécies, essas infecções acometem principalmente pacientes imunocomprometidos. No entanto, a identificação equivocada de isolados clínicos de K. variicola como K. pneumoniae dificulta a intervenção terapêutica, comprometendo o sucesso do tratamento. Dessa forma, a identificação precisa, aliada à caracterização biológica e epidemiológica, é essencial para diferenciar essas espécies e compreender os mecanismos de patogenicidade específicos de K. variicola. Assim como K. pneumoniae, K. variicola apresenta diversos fatores de virulência, incluindo a cápsula polissacarídica (antígeno K), que desempenha um papel crucial na sobrevivência bacteriana no hospedeiro e na formação de biofilme. A cápsula é composta por açúcares sintetizados pela célula bacteriana, e sua relevância como fator de virulência sugere uma possível associação entre a utilização de substratos e a regulação da expressão de genes de virulência e patogenicidade. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre a utilização de carboidratos como fonte única de carbono e a expressão de fatores de virulência em K. variicola. Foram analisadas três linhagens clínicas da espécie, isoladas de urina (Kv 15), cateter (Kv 57) e sangue (Kv 35), provenientes de diferentes pacientes. Inicialmente, avaliou-se o crescimento e a formação de biofilme dos isolados em diferentes fontes de carbono. Após essa análise, quatro açúcares foram selecionados para caracterizar sua influência em experimentos adicionais, incluindo a capacidade de invasão, a produção de sideróforos e a sobrevivência bacteriana em soro humano. Além disso, a expressão do gene mrkA, relacionado à adesão e formação de biofilme, foi quantificada por qRT-PCR.Os resultados demonstraram que a utilização de carboidratos como fontes de carbono influencia diretamente a virulência de K. variicola. A utilização de maltose e sorbitol favoreceu a formação de biofilme, enquanto a galactose impactou significativamente a expressão de genes associados à adesão bacteriana. A sobrevivência em soro humano variou entre os isolados e as condições testadas, indicando um papel regulatório dos açúcares na adaptação bacteriana. Esses achados reforçam a importância de compreender a interação entre metabolismo e virulência em K. variicola, contribuindo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas e diagnósticas mais eficazes no combate às infecções causadas por essa bactéria emergente.

Ao longo dos anos desastres com petróleo têm causado poluições e toxicidade aos ambientes marinhos e terrestres. Tendo em vista estes derramamentos, faz-se necessário reduzir os danos ambientais por meio de técnicas sustentáveis e ecologicamente corretas. Posto isto, a biorremediação pode ser grande aliada neste processo, uma vez que utiliza microrganismos, especialmente bactérias e fungos para degradar as longas cadeias de hidrocarbonetos desses poluentes. Os fungos dispõem de diversas enzimas extra e intracelulares para metabolizar compostos químicos pesados, quando expostos a ambientes estressantes. Os objetivos do presente trabalho visam bioprospectar fungos filamentosos do bioma Cerrado, e observar o seu crescimento em petróleo (PT) e óleo diesel (OD), seguindo-se pelas análises do secretoma. Foram testados 6 fungos, dentre os resultados de bioprospecção, observamos satisfatório crescimento de Paecilomyces formosus (CZJ1), Clonostachys byssicola (CZJ2) e Aspergillus brasiliensis (CZJ3) em meios sólido e líquido. A partir desses resultados, os cultivos desses três fungos filamentosos foram direcionados para análise das proteínas e enzimas secretadas. Além disso, verificou-se a biodegradação dos hidrocarbonetos por meio do indicador redox 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP). Os resultados demostraram concentrações de proteínas totais em diesel de 23,14 µg/mL (P. formosus), 55,05 µg/mL (C.byssicola) e 183,61 µg/mL (A. brasiliensis), e no cultivo com petróleo de 62,09 µg/mL (P. formosus), 38,76 µg/mL (C.byssicola) e 51,70 µg/mL (A. brasiliensis). Assim como, constatou-se a atividade enzimática de manganês-peroxidase (MnP), na qual, C. byssicola apresentou 29,93 (U/mL) em cultivo com diesel, P. formosus e A. brasiliensis apresentaram 8,93 (U/mL) e 15,24 (U/mL) no cultivo com petróleo, respectivamente. Os resultados com DCPIP demonstraram descoloração total do corante em cultivo com diesel para P. formosus, C. byssicola e A. brasilienses e um clareamento parcial da coloração azul para P. formosus e A. brasiliensis cultivados em petróleo, indicando biodegradação dos hidrocarbonetos presentes em ambos os óleos. Nota-se o potencial dos fungos citados para processos biorremediativos, uma vez que se constata a capacidade destes em utilizarem hidrocarbonetos presentes nas substâncias citadas como fonte de carbono e metabolizá-las para o benefício do seu ciclo de vida.

A crescente demanda global por recursos renováveis é impulsionada pela escassez de matérias-primas de origem fóssil. Uma alternativa promissora é a biomassa vegetal, especialmente quando derivada de resíduos agroindustriais. Os carboidratos presentes na composição da biomassa vegetal podem ser utilizados como matéria-prima em processos de fermentação, visando a produção de compostos químicos por microrganismos. Além disso, a transição da economia linear para a economia circular é essencial para mitigar as crescentes ameaças ambientais e de saúde pública decorrentes do aumento da produção de resíduos e do esgotamento dos recursos naturais. Com diversas aplicações industriais, o etileno glicol (EG), um composto orgânico de 2-carbonos, desempenha um papel fundamental como matériaprima na fabricação de tereftalato de polietileno (PET), fluidos anticongelantes, solventes, polímeros e resinas. Em estudos anteriores, nosso grupo de pesquisa desenvolveu uma linhagem recombinante de K. phaffii capaz de produzir EG a partir de xilose por meio de uma nova rota biossintética baseada na via de Dahms. A via é composta pelas enzimas XDH (xilose desidrogenase), XD (xilonato desidratase), ALDO (dehidro-deoxi xilonato aldolase) e ALDR (aldeído redutase). Entretanto observou-se que essa linhagem também foi capaz de oxidar glicolaldeído á Ácido glicólico (AG) por meio de uma aldeído desidrogenase (ALDH) endógena. Com base nessas descobertas 6 genes putavidos para ALDR e ALDH foram selecionados e usados para construção de módulos de deleção baseados na toxina mazF de Escherichia coli. Posteriormente esses módulos foram usados para deletar os genes alvo no genoma de K. phaffii e nesse processo foi obtida uma linhagem recombinante com a deleção de um dos genes confirmada. Além disso, uma série de fermentações em biorreator de bancada foi conduzida, explorando diferentes condições de pH e pO2 (pressão parcial de oxigênio) a fim de determinar as melhores condições para a produção de EG.

A lignina é o polímero aromático mais abundante na natureza. Encontrada na parede celular das plantas, é considerado um subproduto industrial da produção de celulose a partir da madeira. Por conta de sua alta recalcitrância a sua desconstrução se torna um desafio, assim a lignina é muitas vezes descartada pela dificuldade em utilizá-la para gerar produtos de alto valor. Entretanto, atualmente mesmo com essas dificuldades, algumas indústrias são capazes de produzir materiais de interesse econômico, como os elastômeros, resinas fenólicas, termoplásticos, cosméticos entre outros. Isso mostra a capacidade versátil da lignina para ser utilizada em diferentes áreas industriais, apesar da sua dificuldade de desconstrução. Mesmo assim, ainda é preciso entender melhor como desconstruir essa macromolécula, visando gerar produtos de alto valor agregado em um processo industrial rentável, sendo que uma forma de desconstruir a lignina é a desconstrução biológica, processo que ocorre naturalmente no meio ambiente. Microrganismos na natureza, possuem a biomaquinaria necessária para clivar a lignina, sendo os fungos os principais responsáveis por esse bioprocesso. Porém, estudos recentes demonstram que as bactérias também possuem essa capacidade, mas foram menos exploradas. Este trabalho tem como objetivo o estudo sobre o uso de bactérias envolvidos na desconstrução da lignina. Desta forma, amostras de solo do Cerrado brasileiro, de ambientes propícios a degradação de lignina, foram coletadas e inoculadas no meio mínimo M9 com lignina Kraft alcalina (Sigma Aldrich, 4710030) como única fonte de carbono e incubadas a 37 °C, sendo está uma cultura de enriquecimento para seleção de microrganismos capazes de utilizar lignina. A partir da etapa de triagem foram isoladas 81 bactérias, mostrando o grande potencial pouco explorado das bactérias para desconstruir a lignina. Para assegurar a pureza das bactérias isoladas, elas foram inoculadas em colônias únicas em meios frescos por pelo menos três passagens. Para diminuir a quantidade de microrganismos repetidos na colação, somente microrganismos que apresentavam aspectos diferentes uns dos outros, como coloração, opacidade, formato das colônias e tamanho, foram selecionadas e estocadas na coleção. Todas as bactérias foram armazenadas com glicerol 20 %. As bactérias foram então testadas para sua capacidade de crescer em diferentes tipos de ligninas industriais, onde 50 delas conseguiram crescer nos três tipos de lignina testadas, a lignina Kraft Sigma, lignina Kraft industrial e na lignina organosolv industrial. 11 delas cresceram apenas na lignina kraft sigma e kraft industrial e 15 cresceram apenas na kraft Sigma e na organosolv industrial. O DNA dos microrganismos foi extraído pelo método fenol/clorofórmio e utilizado para amplificação por PCR das regiões 16S rDNA das bactérias para que fosse realizado um estudo taxonômico. O DNA de todas as bactérias foi extraído com sucesso, 46 delas tiveram seu rDNA 16S amplificado e 35 foram sequenciados e identificados. O número de bactérias isoladas mostra o potencial desse tipo de microrganismo na desconstrução da lignina. Sendo que a capacidade delas de crescerem em diferentes tipos de lignina é interessante, pois existem poucas bactérias reportadas com capacidade de crescimento em ligninas industriais, porque essas possuem impurezas que podem dificultar o crescimento dos microrganismos. Nosso estudo contribui para o entendimento da utilização desses organismos que estão diretamente envolvidos no reaproveitamento da lignina. Assim, nosso grupo pretende ainda analisar os produtos gerados, buscando identificar produtos que tenham alto valor agregado ou grande demanda comercial para futuramente utilizar o bioprocesso na indústria.

O ácido glicólico (AG) é um ácido orgânico de dois carbonos produzido pela indústria petroquímica e largamente comercializado como cosmético para esfoliação da pele e rejuvenescimento. Além disso, é empregado na indústria têxtil para curtir e pigmentar tecidos, na indústria alimentícia como conservante e acidulante, e na fabricação de polímeros de relevância médica, como o poli(ácido glicólico) e o poli(ácido lático-co-ácido glicólico). Atualmente, a produção do AG se dá por via química a partir de derivados do petróleo, o que gera impactos negativos ao meio ambiente e ao ser humano. Dessa maneira, o uso de biomassa lignocelulósica como substrato para a produção de AG em processos biológicos se apresenta como alternativa sustentável à rota química. Nesse contexto, foi construída pelo nosso grupo de pesquisa uma linhagem de K. phaffii com capacidade de conversão de xilose a etilenoglicol (EG) e a AG por meio da introdução da via heteróloga de Dahms. Na levedura recombinante, foi constatado que a última etapa da via sintética, a conversão de glicolaldeído a AG ou EG, era realizada respectivamente por aldeído redutases (ALDR) e aldeído desidrogenases (ALDH) nativas da levedura. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo a otimização do processo de produção de AG por meio da caracterização dos genes envolvidos na última etapa da via, que poderão ser deletados e superexpressos, de acordo com sua função, na levedura que expressa a via de Dahms para obter maior produção de AG. Para isso, cinco genes putativos de ALDR’s e ALDH’s foram selecionados com base na similaridade de sequência a genes de referência para serem avaliados quanto à sua atividade sobre glicoaldeído. Foram construídos cassetes de deleção para três desses genes. Além disso, para a otimização dos parâmetros do processo de produção de AG, a linhagem de K. phaffii que expressa a via completa de produção de EG e AG foi cultivada em biorreator em diferentes condições de pH e DO (oxigênio dissolvido), de acordo com um delineamento central composto rotacional (DCCR). A partir do DCCR, foi possível determinar que existe influência do pH e do DO para a produção de AG pela K. phaffii engenheirada. Por fim, a levedura engenheirada foi cultivada em biorreator com hidrolisado de biomassa como meio de alimentação para validar a produção de AG a partir dessa fonte de carbono.

Neste trabalho foram estudados os microrganismos já descritos como degradadores de polietileno, os quais foram isolados a partir de resíduos plásticos encontrados em solos do Cerrado por PEIXOTO, 2018 - Comamonas sp., Delftia sp., e Stenotrophomonas sp. O presente estudo consistiu na descrição taxonômica e fenotípica de uma das bactérias, além da caracterização de uma proteína isolada de Delftia sp. Com base na estruturação proposta neste documento, o primeiro capítulo apresenta uma introdução, no qual se justifica a escolha do microrganismo para caracterização taxonômica, para tanto utilizou-se as ferramentas ANI e dDDH, e a seleção da enzima definida para caracterização funcional selecionada a partir de dados genômico e transcritômicos do microrganismo cultivado com polietileno. O segundo capítulo, por sua vez, descreve a caracterização taxonômica da linhagem Comamonas sp. PE 63. A classificação taxonômica baseada na análise do genoma confirmou o potencial de essa estirpe consistir em uma nova espécie dentro do seu gênero, apresentando como vizinho filogenético mais próximo a C. testosteroni ATCC 11996, com dDDH de 48,6% e ANI < 93%. A análise do perfil de ácidos graxos revelou as distinções entre a PE 63 e a ATCC 11996. Além disso, foram realizadas análises comparativas de pangenoma, predição de genes e caracterização fenotípica in silico, complementando o estudo taxonômico e filogenético da Comamonas sp. PE 63. O terceiro e último capítulo descreve a caracterização bioquímica de uma peroxirredoxina produzida pelo isolado Delftia sp. PE 138. A proteína foi selecionada com base em dados de expressão diferencial durante o cultivo de Delftia sp. com polietileno como única doente de carbono. Para tanto, realizou-se a expressão heteróloga e a purificação da peroxirredoxina. Os resultados bioquímicos indicaram que a proteína é estável em uma ampla faixa de temperatura (10 a 45 °C) e que o pH ótimo de atividade é 7. Além disso, a proteína apresentou estabilidade durante sete dias quando incubada a 30 °C. Por meio de técnicas computacionais, a estrutura tridimensional dessa proteína foi prevista e validada. Os efeitos da temperatura, pH e tratamento com DTT e H2O2 nas estruturas secundárias da proteína foram inferidos por meio da técnica de dicroísmo circular. Os resultados obtidos nesse trabalho auxiliam no direcionamento de novas pesquisas no estudo de gestão de resíduos plásticos, visto que uma bactéria não descrita anteriormente e com potencial para degradação de plásticos foi caracterizada, bem como uma enzima com possível influência na biodegradação.

A presente tese aborda dois desafios cruciais na análise de dados genômicos: a agregação e complementação de metadados e a classificação filogenética de sequências biológicas. Para resolver o primeiro desafio, desenvolvemos o GeneConnector, uma ferramenta que agrega e complementa metadados de registros do GenBank, explorando informações compartilhadas entre diferentes sequências de um mesmo espécime. A aplicação do GeneConnector ao banco de dados GOPHY demonstrou sua eficácia na recuperação de informações valiosas sobre a origem, coleta e processamento das amostras, com ganhos de informação de até 60%. Adicionalmente, introduzimos os scores Observed Completeness Score - OCS e Reachable Completeness Score - RCS para avaliar a completude dos metadados e o potencial de enriquecimento de informações. Para o segundo desafio, desenvolvemos o Classeq, uma ferramenta de classificação de sequências biológicas baseada em posicionamento filogenético, rápida, precisa, independente de alinhamentos múltiplos de sequências e capaz de classificar sequências de genes inteiros. Nossos testes com o Bacillus subtilis group demonstraram a alta sensibilidade e especificidade da ferramenta, classificando corretamente quase todas as sequências do grupo em seus respectivos clados. Adicionalmente, o Classeq oferece uma interface de usuário amigável e uma API para facilitar sua integração em fluxos de trabalho existentes. Em suma, o GeneConnector e o Classeq representam avanços significativos na análise de dados genômicos, com potencial para impulsionar pesquisas em diversas áreas. Ao abordar os desafios de agregação de metadados e classificação filogenética, essas ferramentas oferecem novas perspectivas para a interpretação e utilização de dados genômicos, abrindo caminho para descobertas e aplicações inovadoras.

Organismos halófilos crescem em ambientes com altas concentrações de sais e estão distribuídos nos três domínios da vida: Bacteria, Eukarya e Archaea. Tais ambientes incluem águas salgadas, solos, alimentos salgados fermentados e sais alimentares. A presença de procariotos halófilos em sais alimentares é comum e foi descrita em vários trabalhos científicos, no entanto, não há informações sobre sua ocorrência em sais comercializados no Brasil. Assim, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização de procariotos halófilos extremos presentes em sais alimentares, inicialmente por meio de abordagens dependentes de cultivo. Alíquotas de quatro sais comerciais foram inoculadas em dois meios de cultura para halófilos (ATCC e MGM), adicionados de 3 ou 4 M de NaCl, na busca de organismos halófilos extremos. Os resultados obtidos sugerem a presença tanto de bactérias como de archaeas nos sais analisados, uma vez que foi observado o crescimento microbiano em todos os meios analisados. Em sua grande maioria, as colônias obtidas apresentavam coloração avermelhada, típica de archaeas halófilas, enquanto a análise microscópica revelou a presença tanto de cocos como bacilos, predominantemente Gram negativos. Todas as culturas foram submetidas à extração de DNA, seguida de PCR, com iniciadores específicos para Archaea e Bacteria. Amplicons obtidos a partir de alguns dos sais foram então ligados a vetores de clonagem e transformados em células de Escherichia coli XL1-Blue. Clones recombinantes foram analisados por sequenciamento de DNA e os resultados revelam a presença de archaeas cujos genes de rRNA 16S exibem elevado grau de identidade com os respectivos genes das archaeas dos gêneros Halobacterium e Halolamina

Infecções no trato urinário (ITUs) são a causa mais frequente de infecções bacterianas em seres humanos. Estima-se que a cada ano, aproximadamente 150 milhões de pessoas são acometidas por essa patologia em todo o mundo. Responsável por 80%-90% dos casos, a enterobactéria Gram-negativa conhecida como Escherichia coli uropatogênica (Uropathogenic Escherichia coli – UPEC), é o agente causador mais comum de ITUs adquiridas na comunidade. A capacidade de UPEC em sobreviver no trato urinário depende tanto de sua fisiologia e metabolismo quanto de seus determinantes de virulência. Recentemente, foi demonstrado que há uma ligação entre o transporte e o metabolismo de vários carboidratos e a virulência em enterobactérias. Todavia, como o papel preciso da utilização de carboidratos na expressão e regulação da virulência bacteriana ainda não foi determinado, buscamos compreender o impacto que o metabolismo de diferentes fontes de carbono tem sobre a expressão de fatores de aptidão e virulência na patogênese de UPECs resistentes à múltiplas drogas (MDR), com ênfase na expressão das fímbrias tipo 1. O objetivo deste trabalho é compreender o efeito que o uso de diferentes fontes de carbono tem sobre a expressão de genes e mecanismos de virulência de linhagens UPECs MDR. Para este fim, quatro linhagens diferentes de UPECs MDR (representantes do grupo A, B1, B2 e D) foram submetidas a determinação do perfil de resistência aos antibióticos, a análise da capacidade de sobrevivência e reprodução (fitness bacteriano), de expressar fímbrias tipo 1 funcionais, de formar biofilme utilizando diferentes fontes de carbono e de sobreviver em sangue e soro. Em condições anaeróbicas semelhantes a encontrada ao longo do trato urinário, todas as UPECs analisadas utilizaram D-(-)-Sorbitol como fonte de carbono de alto rendimento. Três das quatro estirpes analisadas não utilizam D-(-)-Frutose como fonte de carbono para seu crescimento. Os dados obtidos através do Ensaio de Aglutinação de Levedura sugerem que o metabolismo de D-(-)-Frutose tem relação com a expressão de fímbrias tipo 1 funcionais na superfície celular de três das quatro estirpes analisadas. UPEC 76 não utilizou D-(-)-Frutose como fonte de carbono para seu crescimento ou para expressar fímbrias tipo 1 funcionais. Todas as UPECs analisadas são classificadas como produtoras moderadas de biofilme quando crescidas em N-acetil-D-glicosamina. Três das quatro estirpes apresentaram uma capacidade aumentada de sobreviver em sangue e soro ao utilizar N-acetil-D-glicosamina como fonte única de carbono. Em conjunto, nossos dados sugerem que o metabolismo de diferentes fontes de carbono (açúcares) modulam a expressão de fatores de virulência como o crescimento exarcebado, a expressão de fímbrias tipo 1 funcionais e a resistência ao soro em diferentes estirpes de Escherichia coli uropatogênica resistentes à múltiplas drogas de origem clínica.

Corynebacterium glutamicum é uma bactéria não patogênica amplamente utilizada na produção industrial de aminoácidos, moléculas que se encontram em terceiro lugar no mundo entre as mais produzidas por meio da fermentação, atingindo milhões de toneladas e com números crescentes no mercado mundial. C. glutamicum tem sido amplamente estudada, uma vez que os métodos tradicionais utilizados para produção de aminoácidos demandam um alto custo com isso, alternativas estão sendo buscadas a fim de baratear a produção e aumentar a produtividade. Nesse contexto, a proteômica tem desenvolvido papel fundamental para compreender e melhorar a eficiência de produção de aminoácidos, visto que o entendimento das vias de biossíntese depende da interpretação de análises proteômicas. Isso porque com a proteômica existe possibilidade de descrição e caracterização do funcionamento das vias metabólicas, sendo capaz de identificar modificações pós-traducionais (PTMs), além de ser apta para identificar a degradação de proteínas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo geral identificar e caracterizar proteínas e complexos proteicos que participam das vias da biossíntese de aminoácidos dessa bactéria, com a influência de Tween 40 para produção de glutamato, por meio da abordagem proteômica de espectrometria de massas bottom-up, analisando o perfil proteico intracelular e extracelular. A análise de aminoácidos secretados pelo microrganismo resultou, no tempo de 18h de cultivo, a concentração de glutamato de 0,70 ± 0,14 mM na condição tween 40, enquanto na condição controle foi de 0,04 ± 0,02 mM (Teste t p<0,05). Os complexos proteicos foram separados via eletroforese BN-PAGE, apresentando complexos proteicos intracelulares variando entre 20kDa e 720kDa. Foram identificadas proteínas importantes para o metabolismo da C. glutamicum , como a enolase e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase , pertencentes a via glicolítica e a glutamina-sintetase, envolvida na biossíntese de glutamato. A análise do perfil proteico extracelular por SDS-PAGE apresentou proteínas entre 10 a 80 kDa, sugerindo diferença na abundância de algumas proteínas entre as condições. Na análise, bottom-up por LCMS/MS do secretoma, foi possível identificar algumas protéinas reguladas mais abundantes na condição com tween 40, como 2-oxoglutarato desidrogenase que é precursor da síntese de L-Glutamato. Tais resultados possibilitam a melhor compreensão do maquinário bioquímico envolvido na produção e secreção de aminoácidos por Corynebacterium glutamicum e, ajudar no aperfeiçoamento da sua manipulação científica em direção aos interesses biotecnológicos.

A demanda global de energia e a preocupação com o desenvolvimento de uma economia sustentável têm incitado a busca por processos para a obtenção de compostos químicos com potencial para substituir, ao menos em parte, os oriundos de fontes fósseis não renováveis. Nesse contexto, a biomassa lignocelulósica apresenta grande potencial como matéria-prima alternativa e renovável para a produção de compostos de alto valor agregado através de bioprocessos. Um dos principais desafios nesses processos refere-se à presença de inibidores no hidrolisado lignocelulósico, os quais são formados ou liberados durante as etapas de pré-tratamento e hidrólise da biomassa. São compostos que podem inibir o metabolismo microbiano e, consequentemente, o rendimento e produtividade dos bioprocessos. Os inibidores estão reunidos em 3 grupos principais: ácidos orgânicos (p. ex. ácidos acético, fórmico e levulínico), furaldeídos (furfural e 5- hidroximetil-2-furaldeído) e compostos fenólicos. Estudos anteriores demonstram o potencial da levedura Komagataella phaffii de manter-se ativa na presença desses inibidores. Assim, análises fisiológicas e transcriptômicas de K. phaffii revelaram genes com potencial para aumentar a tolerância da levedura a furaldeídos, ácido acético e hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar. Esse trabalho objetiva a validação da expressão de cinco genes putativos - YJR096W, YDL124W, SAP30, FLR1 e 2661 – na resposta de K. phaffii M12 na presença de diferentes inibidores, em diferentes condições de cultivos fermentativos. Inicialmente, cada um dos genes foi amplificado por PCR e clonado no vetor de clonagem pGEM®-T Easy. Para clonagem no vetor de expressão pKLD, sob controle do promotor PGK1, empregou-se os sítios de clonagem BamHI/NotI e BcuI. Até então, linhagens de K. phaffii expressando o gene YJR096W foram construídas com sucesso. Ensaios em microplaca e frasco Erlenmeyer foram realizados para avaliar as respostas da linhagem recombinante aos inibidores furfural, HMF e hidrolisado lignocelulósico. A linhagem controle e a recombinante demonstraram os mesmos perfis de crescimento, consumo de substrato e formação de produtos na presença de HMF 2 g/L, furfural 3 g/L e hidrolisado lignocelulósico 30%. Assim, nas condições de cultivo avaliadas até então, a superexpressão do gene YJR096W, em K. phaffii M12, não resultou em aumento de tolerância à presença dos inibidores furfural, HMF e hidrolisado lignocelulósico. As próximas etapas envolvem a superexpressão dos demais genes e validação das linhagens recombinantes.

A resistência antimicrobiana (RAM) acontece quando bactérias não respondem às terapias ofertadas tornando as infecções mais difíceis de serem tratadas podendo levar à morte do paciente. Serratia marcescens é uma enterobactéria responsável por causar infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) e, frequentemente, apresentam RAM. Esta espécie é considerada um agente causador de infecções oportunistas de tratamentos desafiadores devido à presença de vários tipos de mecanismos promotores de RAM. Neste contexto, é fundamental que se amplie o estudo dos mecanismos de disseminação de RAM visando o diagnóstico rápido e preciso, além do rastreamento epidemiológico para interromper a cadeia de transmissão de RAM dentro do ambiente. No presente trabalho, Quatro (4) isolados de Serratia marcescens causadores de bacteremia em pacientes internos em uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI) foram submetidos à determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana e de epidemiologia molecular. A determinação do perfil de susceptibilidade antimicrobiana foi determinada por testes fenotípicos (antibiograma por métodos automatizados, disco difusão e imunocromatografia), genotípico para a detecção de beta-lactamases (PCR) e por genômica (sequenciamento WGS). O delineamento da cadeia de transmissão dos isolados foi determinado por epidemiologia molecular através da análise de fingerprinting de sequencias repetitivas intergênicas para enterobactérias (ERIC-PCR) e por pangenoma. As análises fenotípicas e de genômica para não susceptibilidade demonstram que todos os isolados se apresentaram resistentes a todos antimicrobianos disponíveis sendo classificados como pan-resistentes (PDR). A imunocromatografia identificou as carbapenemases KPC e NDM em todos os isolados, contudo a genotipagem por PCR identificou KPC apenas em 2 isolados e a genômica não identificou a enzima em nenhum deles. As análises de similaridade genética por ERIC-PCR e pangenomica determinou que os isolados se apresentaram filogeneticamente idênticos e, portanto, clonais. Em sua totalidade os resultados indicam que análises genômicas por WGS são ferramentas precisas e robustas para o diagnóstico de RAM, contudo a mesma deve ser realizada imediatamente após o isolamento bacteriano para evitar diagnósticos imprecisos devido a perdas de elementos genéticos instáveis, como no caso de blaKPC que codifica a enzima KPC. A análise de pan-genoma, também, demonstrou-se precisa para a identificação de clones bacterianos entre os isolados, além de possibilitar identificar a presença de clones de disseminação mundial.

O estudo de virus é de extrema importância para a sociedade, pois compreende o estudo organismos responsáveis por causar inúmeras doenças. O monitoramento regular de vírus isolados de culturas é muito importante com relação a virologia de plantas. A identificação rápida e precisa de vírus potencialmente perigosos pode prevenir surtos graves em culturas de importância econômica. Atualmente, as tecnologias de High Throughput Sequencing (HTS) tornaram-se uma ferramenta acessível e poderosa para essa finalidade. Neste estudo, avaliamos o uso de amostras de águas residuais para monitorar vírus de plantas usando análise HTS e RT-qPCR. Vírus de plantas pertencentes a 12 famílias de vírus foram encontrados, dos quais Virgaviridae, Solemoviridae, Tymoviridae, Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae, Closteroviridae e Secoviridae foram os mais abundantes com mais de 20 espécies. Além disso, um virus quarentenário e uma nova espécie de tobamovírus também foram descobertos. Também foi analisada a relevancia de alimentos processados como fonte desses virus em águas residuais. O Pepper tobamo mild mottle virus (PMMoV) foi detectada em abundância em amostras de alimentos processados à base de pimenta e amostras de esgoto, e o Common garlic latent carlavirus (GarCLV) foi detectado em menor quantidade em amostras de alho seco e fresco e amostras de esgoto. Isso mostrou uma alta correlação entre a abundância viral no esgoto e nas fontes de alimentos processados. O uso potencial de águas residuais para pesquisa de vírus é discutido neste estudo. Além do monitoramento de virus, também é de grande importância o estudo de virus já conhecidos que também podem ter importância econômica não apenas no quesito fitossanitário, mas também tecnológico como o uso de vetores de expressão. O pepper ringpot virus (PepRSV) até o momento é o único tobravírus relatado no Brasil. Ele vem sendo usado como vetor viral para produção de proteínas recombinantes. Porém, por ser um virus restrito ao Brasil, ainda é um virus pouco estudado quando comparada a outras espécies também utilizadas para este fim. Este trabalho também apresenta como objetivo o estudo de uma putativa nova ORF N1 do PepRSV, para isso construções mutantes da ORF N1 foram agroinfiltradas em folhas de Nicotiana benthamiana e sua localização intracelular, a partir da fusão da proteína com proteínas de florescência para serem observadas por microscópio confocal. Com as construções mutantes podemos observar sintomas distintos como a ativação de lesões locais, murcha e tombamento, antes não verificados nos clones infecciosos originais. ORFN1/GFP mostrou localização associada ao reticulo endoplasmático.

A biomassa lignocelulósica é a matéria-prima renovável mais abundante no planeta e o seu máximo aproveitamento é fundamental para uma economia mais sustentável. Entre os desafios da sua utilização por microrganismos, estão a eficiente assimilação dos açúcares que a compõem e a tolerância desses organismos aos compostos inibitórios derivados das etapas de pré-tratamento e hidrólise da lignocelulose. Entre eles, o ácido acético é o principal ácido liberado durante a despolimerização da lignocelulose e exerce forte efeito inibitório ao crescimento microbiano, consequentemente comprometendo seu metabolismo e a produção de compostos de interesse. O fator de transcrição Haa1 previamente descrito em Saccharomyces cerevisiae é o principal regulador da resposta celular ao estresse fisiológico causado pela presença de ácido acético e a sua superexpressão apresenta potencial para favorecer o desempenho de outras leveduras na presença desse inibidor. Neste trabalho, o desempenho de linhagens recombinantes de Komagataella phaffii superexpressando o fator de transcrição Haa1 homólogo foi avaliado na presença de ácido acético e hidrolisado lignocelulósico. Adicionalmente, também foi avaliado o efeito da superexpressão de Haa1 sobre a produção de ácido xilônico por K. phaffii. A superexpressão de Haa1 conferiu à levedura maior tolerância ao ácido acético entre 4 g·L-1 e 6 g·L-1 reduzindo o tempo de destoxificação em até 12 horas e aumentando a produção de biomassa da levedura em até 37%. O efeito da superexpressão de Haa1 não demostrou, no entanto, efeito significativo na produção de ácido xilônico por K. phaffii quando essa foi cultivada em batelada alimentada com glicose e xilose. Os resultados obtidos demonstram a eficiência de Haa1 no aumento da tolerância a ácido acético e abrem caminho para melhorar o desempenho da levedura na produção de ácido xilônico.