Banca de QUALIFICAÇÃO: Marina Borges Guimarães

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Marina Borges Guimarães
DATA : 01/11/2022
HORA: 14:00
LOCAL: Plataform Conferência Web UnB
TÍTULO:

EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA L-ASPARAGINASE DO FUNGO Penicillium sizovae EM Escherichia coli BL21 (DE3)

PALAVRAS-CHAVES:

L-asparaginase; fungo; expressão heteróloga; leucemia linfoide aguda

PÁGINAS: 100
RESUMO:

A enzima L-asparaginase (L-ASNase) foi a primeira enzima terapêutica descoberta e é utilizada no tratamento de leucemia. Seu mecanismo de ação consiste em catalisar a hidrólise da L-asparagina em ácido aspártico e amônia. Apesar de ser a primeira linha de tratamento para a LLA, ainda não existe produção de L-ASNase no Brasil. Além disso, todos as formulações de L-ASNase aprovadas e disponíveis no mercado são de origem bacteriana (de Escherichia coli nativa e peguilada, e de Erwinia chrysantemi), entretanto estas formulações causam toxicidade e hipersensibilidade nos pacientes. L-ASNases oriundas de fungos possuem menos efeitos adversos, no entanto sua produtividade é baixa. Visando a produção de uma L-ASNase com menos efeitos adversos e maior rendimento, este trabalho tem como objetivo a clonagem e expressão do gene da L-ASNase do fungo Penicillium sizovae em E. coli BL21(DE3). A clonagem foi confirmada por PCR e Western Blot. A lise celular foi realizada por sonicação e as frações solúveis e insolúveis foram avaliadas por intensidade de banda em SDS-PAGE. Foi observado que a enzima estava presente apenas nas frações insolúveis, sugerindo a presença de corpos de inclusão (CI). Para identificar as melhores condições cultivo para se obter L-ASNase nas frações tanto solúvel quanto insolúvel, foi realizada uma triagem com diferentes concentrações de IPTG (0,1 mM; 0,5 mM e 1 mM), tempo pós-indução (2 h, 4 h, 8h, 12 h, 20 h e 24 h) e temperatura de indução (20 ºC e 37 ºC). Após seleção dos cultivos por intensidade das bandas em SDS-PAGE, foram obtidas atividades de L-ASNase pelo método de AHA nas frações solúveis dos cultivos a 20 ºC, sendo a maior atividade de 0,02 U/mL (0,5 mM de IPTG e 24 h pós indução). A atividade da enzima também foi testada na biomassa destes cultivos, sendo os maiores valores obtidos nas condições de 0,5 mM de IPTG, 24 h pós indução (2,5 U/gcell) e em 0,5 mM de IPTG, 4 h pós indução a (1,9 U/gcell). Para os cultivos selecionados a 37 ºC, não houve atividade de L-ASNase nas frações solúveis nem insolúveis, indicando a formação de CI. Foram realizados testes de solubilização com ureia nas concentrações de 2 – 8 M, podendo assim ser identificadas as molaridades de ureia capazes de solubilizar os CI para cada cultivo. Ainda assim, testes para o redobramento da enzima à sua conformação original ainda são necessários para que a enzima retorne à sua conformação ativa.

MEMBROS DA BANCA:
Externo ao Programa - 2122696 - EDIVALDO XIMENES FERREIRA FILHO
Externa ao Programa - 2222088 - ELIANE FERREIRA NORONHA
Externa ao Programa - 1529483 - MARIA DE FATIMA BORIN
Presidente - 1562111 - PEROLA DE OLIVEIRA MAGALHAES DIAS BATISTA
Externo ao Programa - 1661623 - RICARDO HENRIQUE KRUGER