O gênero Burkholderia, inclui cepas amplamente distribuídas em solo, água e ambientes hospitalares, reconhecidas por sua relevância ambiental, industrial, biotecnológica e clínica. Espécies deste gênero produzem metabólitos secundários e sideróforos com ação fungicida e bactericida. Burkholderia contaminans (Bco) destaca-se pela capacidade de promover o crescimento vegetal, pela atividade antagônica contra fitopatógenos e por atuar na biorremediação. Neste estudo, o isolado UnB1430, obtido de folhas de gerânio, foi identificado como B. contaminans (Bco) por meio de sequenciamento total do genoma utilizando a tecnologia Oxford Nanopore PromethION. A identidade nucleotídica média (ANI) superior a 95%, determinada com o programa fastANI, foi o critério utilizado para confirmação de sua classificação no nível de espécie. O isolado UnB1430 foi avaliado in vitro quanto à sua capacidade de antagonismo, antibiose, produção de sideróforos, compostos voláteis e resistência a antibióticos. Houve inibição significativa do crescimento de todos os fungos e bactérias avaliados (total de 23 espécies), com variações na atividade inibitória entre as espécies. O isolado também foi avaliado em condições de casa de vegetação quanto ao seu potencial para o biocontrole da podridão-radicular da soja causada por Rhizoctonia solani, em pré e pós-emergência, assim como pelo seu efeito como promotor de crescimento em plântulas de soja. Os resultados indicaram que UnB1430 reduziu visivelmente a severidade da doença em plântulas de soja, embora sem diferença significativa.em relação às plântulas inoculadas apenas com R. solani. Por outro lado, as plântulas inoculadas com Bco nas sementes, em concentração de 108 UFC/mL, apresentaram maior peso seco em comparação com as não tratadas. A análise do genoma para identificar genes relacionados à produção de metabólitos secundários, promoção de crescimento, virulência e resistência a antibióticos, foi realizada utilizando as bases de dados antiSMASH, PLaBase, VFDB e CARD, e mostrou que Bco UnB1430 apresenta clusters de genes biossintéticos (BGCs) com mais de 50% de similaridade com clusters conhecidos, associados à biossíntese de N-aciloxiacil glutamina, pioquelina, ornibactina C4/C6/C8, pirrolnitrina e occidiofungina. Detectou-se a presença de genes relacionados à promoção de crescimento, associados a funções na assimilação de nutrientes, produção de fitohormônios e sideróforos. Já os genes de resistência a antibióticos (ARGs) detectados estão relacionados a mecanismos mediados por bombas de efluxo, pertencentes às famílias de resistência, nodulação e divisão celular (RND) e resistência a múltiplas drogas (SMR). Além disso, o genoma exibiu ausência de sistemas de secreção associados à virulência, bem como de genes essenciais para adesão e motilidade invasiva, o que reforça o perfil não patogênico do isolado. Com base nas sequencias genômicas, foram desenhados três pares de primers e um deles, BurkCF3/R3 mostrouse específico para Bco, frente às demais bactérias testadas. Os resultados deste trabalho corroboram estudos anteriores e destacam o potencial de Bco como antagonista e promotor de crescimento de plantas.

O tomateiro (Solanum lycopersicum) é uma das hortaliças mais cultivadas no mundo, com grande relevância econômica. No entanto, a cultura é frequentemente afetada por doenças virais que comprometem seu desenvolvimento e produtividade. Recentemente, foi observada em lavouras de tomate no Programa de Assentamento Dirigido do Distrito Federal caracterizada por forte enrolamento foliar, clorose internerval e nanismo, afetando várias plantas. A realização de testes de detecção com análises moleculares das amostras sintomáticas revelou o potencial agente causal como tomato apical leaf curl virus (ToALCV), membro da espécie Topilevirus solani pertencente ao gênero Topilevirus, da família Geminiviridae, que já foi detectado no Distrito Federal e relatado pela primeira vez na Argentina. Considerando os fortes sintomas como uma ameaça ao cultivo do tomateiro e a falta de informações sobre sua biologia e vetores, este trabalho teve como objetivo investigar aspectos da interação entre o ToALCV, seus hospedeiros e possíveis vetores. Para isso, foi construído um clone infeccioso do vírus, inserido em vetor binário. Esse clone demonstrou ser funcional, permitindo a reprodução dos sintomas observados em campo e o cumprimento dos postulados de Koch. O clone representa o isolado de ToALCV obtido diretamente das lavouras infectadas. Esse clone foi utilizado em inoculações mediadas por Agrobacterium tumefaciens em cultivares híbridas e de polinização aberta comerciais de tomateiro, com o objetivo de avaliar sua suscetibilidade à infecção. Todos os materiais testados, Arezzo, Atari, Candieiro, Compack, Dominador, Gaúcho, Lampião, Matinella, Mascot, Nivus, Parma, Santa Clara, Santa Cruz, BRS Sena e Tyson, foram suscetíveis à infecção por ToALCV, incluindo os com resistência moderada a begomovírus, embora em graus variados de suscetibilidade conforme a cultivar. Adicionalmente, foram realizados testes de transmissão mecânica e experimentos em condições laboratoriais para investigar potenciais insetos vetores. A mosca-branca (Bemisia tabaci) e a cigarrinha (Agallia albidula) não se mostraram vetores do ToALCV, e o vírus também não foi transmitido mecanicamente para plantas sadias de tomateiro. Os resultados obtidos contribuem para o entendimento da doença causada por ToALCV, mas reforçam a necessidade de continuidade nos trabalhos de caracterização do vírus, seus mecanismos de transmissão e manejo.

A banana (Musa spp.) é considerada uma das frutas mais consumidas no mundo e componente básico da alimentação de milhões de pessoas. É considerada como fonte importante de carboidratos, vitaminas e minerais. As bananas comerciais são oriundas do cruzamento entre duas espécies selvagens, Musa acuminata (A) e Musa balbisiana (B). As cultivares que possuem características uniformes são classificadas dentro de subgrupos. Muitas dessas cultivares são estéreis, com o desenvolvimento dos frutos ocorrendo por partenocarpia. Devido à consequente variabilidade genética limitada, as cultivares comerciais tendem a ser suscetíveis ao ataque de inúmeras pragas e doenças, responsáveis pelas maiores perdas na produtividade das lavouras e na qualidade dos frutos. A Murcha de Fusarium é uma doença clássica de murcha vascular causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc). As perdas podem atingir 100% da produção nas áreas afetadas, e a persistência de clamidósporos do fungo em solos contaminados torna-os impróprios para a produção continuada de banana. Foc é subdividida em quatro raças, baseada na patogenicidade a diferentes cultivares de bananas. A raça 1 é patogênica às cultivares Gros Michel (AAA), Maçã e Prata (AAB), a raça 2 é patogênica às cultivares Bluggoe (ABB), e a raça 4 patogênica a todos os subgrupos e à Cavendish (AAA). A raça 4 é subdivida em raça tropical 4 (TR4) e subtropical 4 (STR4), por STR4 ser patogênica a cultivares ‘Cavendish’ apenas em regiões subtropicais e com menor agressividade que TR4. A medida de controle mais eficiente é através da resistência genética, sendo a genômica uma das importantes ferramentas de introgressão de genes de cultivares selvagens e resistentes à patógenos, em cultivares comerciais. Com isso, o objetivo desse trabalho foi identificar e validar genes alvo envolvidos na resistência de Musa durante a interação com o patógeno Foc STR4, via análise de RNAseq. Para isso, dois genotipos contrastantes foram utilizadas para investigação da interação com o isolado de Foc STR4 isolado CNPMF 218A: ‘Calcutta 4’ (genótipo selvagem resistente) e ‘Prata-Anã’ (genótipo comercial suscetível). A inoculação foi realizada utilizando arroz inoculado na concentração de 106 UFC/g. O RNA total foi extraído de amostras de raízes coletadas aos 1, 2 e 4 dias após a inoculação (DAI) com o patógeno para as análises de RNAseq. Análises histológicas foram realizadas para investigar respostas de defesa da planta, como a deposição de calose e produção de compostos fenólicos nos mesmos tempos de inoculação, bem como acompanhar o processo de infecção do isolado de STR4 em ambos os genótipos acrescidos dos dias 8 e 15 DAI. O estudo da histologia mostrou resposta de defesa pós formadas apenas em ‘Calcutta 4’ com a formação de calose e compostos fenólicos aos 1 e 2 DAI. Somente foi observada evidência de colonização de Foc STR4 em ‘Prataanã’, aos 8 e 15 DAI. Um total de 1416 genes diferencialmente expressos foram observados durante a interação de ‘Calcutta 4’ e Foc STR4, com 270, 872 e 81 DEGs aos 1, 2 e 4 DAI, respectivamente. Destes, 752 DEGs foram regulados positivamente aos 2 DAI, indicando uma rápida ativação de genes de defesa contra o ataque de Foc STR4. Através das análises funcionais utilizadas, GO, KEGG, KOG, Interpro e Mapman, foram identificados diversos DEGs envolvidos nas respostas imediatas de defesa de ‘Calcutta 4’ à Foc STR4, como a ativação de PRRs (receptores de reconhecimento de padrões), PRs (proteínas relacionadas à patogênese), quitinases, fitormônios como etileno (ET), ácido jasmônico (JA) e ácido abscísico (ABA), genes de resistência (R) como NLRs (nucleotide-binding site leucine-rich repeat), fatores de transcrição (TFs), espécies reativas de oxigênio (ROS), SAR (resistência sistêmica adquirida), fitoalexinas e calose. Esses genes são responsáveis por participarem em diferentes vias funcionais como a resposta a estímulos, interação plantapatógeno, metabolismo secundário, vias de fitormônios e estresse biótico. A ação conjunta das vias sinalizadas são fundamentais para o processo de resistência do genótipo selvagem à Foc STR4. A descoberta desses genes ajudará no processo de seleção de genes candidatos de resistência à Foc no uso de ferramentas de melhoramento genético, como a introgressão de genes de resistência de genótipos selvagens em cultivares comerciais, como ‘Prata-anã’, e nas demais técnicas de edição gênica como CRISPR. Essa estratégia é promissora para o desenvolvimento de variedades de bananas resistentes à Murcha de Fusarium causadas por Foc STR4 e TR4, onde a implementação de organismos geneticamente modificados (OGMs) com foco em genes associados a interações planta-patógeno e estresse biótico podem fortalecer o cultivo de banana e reduzir o impacto de epidemias de Murcha de Fusarium na produção nacional.

Os vírus Coguvirus citrulli e Coguvirus henanense (WCLaV-1 e -2), membros do gênero Coguvirus, foram recentemente relatados em melancia no Brasil em infecção mista com Orthotospovirus arachianuli (groundnut ringspot virus, GRSV) (Maeda et al. 2021). Os sintomas observados em plantas de melancia infectadas com WCLaVs e GRSV são amarelecimento, enrolamento. Tem-se poucas informações sobre da doença no país, como perdas de produção, outros hospedeiros importantes economicamente e o vetor de transmissão. Este projeto tem como objetivo desenvolver métodos de detecção sorológico para WCLaV-1 e -2 e elucidar a habilidade de transmissão por semente e sublocalização celular. Os trabalhos já estão em fase de finalização. Os anticorpos policlonais contra WCLaV-1 e -2 foram produzidos usando as proteínas do nucleocapsídeo (N) do WCLaV1 e WCLaV-2 geradas transientemente em plantas de Nicotiana benthamiana usando o vetor viral pepper ringspot virus (PepRSV). Essas proteínas foram injetadas em coelhos e os antissoros resultantes foram avaliados. A especificidade foi confirmada por ensaio de “dot-imunobinding assay” (DIBA), “antigen-coating ELISA”, “tissue blot immunobinding assay” (TBIA) e Western blot, sendo que esses anticorpos poderão ser utilizados para testes de detecção e estudo de interação dos coguvírus com plantas. Foi demonstrado que WCLaV-1 apresentou 93,1% de transmissão por semente de melancia da cultivar 'Crimson Sweet', enquanto WCLaV-2 mostrou apenas 17,8%, confirmadas por teste sorológico. A análise de tecido infectado por TBIA indicou a presença de WCLaV1 nas sementes e plântulas. A proteína N de WCLaV-1 foi principalmente detectada no citoplasma dos tecidos da semente e, notavelmente, também foi encontrada no núcleo das células da ponta da raiz, em observações realizadas por microscopia confocal. O clone infeccioso de PepRSV, que possui 2 segmentos genômicos (RNA1 e RNA2), ambos estão clonados no vetor binário pJL89. Geralmente, o clone infeccioso de PepRSV causa infecção sistêmica em plantas de Nicotiana benthamiana quando infiltrado via Agrobacterium tumefaciens. Além disso, pode ser utilizado como vetor viral para expressão heteróloga, substituindo o gene da capa proteica (CP) do PepRSV pelo gene de interesse. Os antígenos da proteína N dos WCLaV-1 e -2 foram produzidos dessa forma neste trabalho. Ao longo do estudo do vírus PepRSV, foi obtido um clone mutante, denominado clone 4, do RNA2 que possui uma mutação atípica, isto significa a inserção de uma citidina na extremidade 3’ do gene da CP. Quando o clone 4 foi inoculado em N. benthamiana em conjunto com o RNA1 de PepRSV, houve a produção de sintomas de lesão necrótica local (hypersensitive reaction-like ou HR-like) na folha inoculada. Em contraste, outro clone do RNA2, denominado clone 2, que apresenta sequência genômica tipo selvagem (sem ocorrência de mutação), nas mesmas condições causa infecção sistêmica não causando lesão necrótica local. Para compreender o mecanismo de indução de resposta HR-like pelo clone 4, elaborou-se um estudo para compreender a função dessa região genômica na resposta de defesa de Nicotiana bethamiana contra a infecção do PepRSV. O objetivo deste estudo é avaliar a ativação de espécies reativas de oxigênio (com ênfase em peróxido de hidrogênio), formação de calose e monitorando a expressão de cada gene indicadores por RT-qPCR, quando o clone 4 é agroinfiltrado em N. benthamiana. Com esses resultados, será possível direcionar a compreensão de quais mecanismos podem estar associados ao sintoma de lesão necrótica local ou ativação, inibição ou sinergismo das vias de defesa PTI e ETI.

A cultura da banana (Musa spp.) é uma das frutas mais consumidas no mundo e está sujeita a estresses abióticos e bióticos. A seca e nematoides são um problema em grandes áreas produtoras, principalmente devido a suscetibilidade das cultivares comerciais que estão sujeitas ao estresse hídrico e a infecção pelo endoparasita formador de galhas radiculares Meloidogyne incognita. Embora um número limitado de estudos tem sido voltados para compreender a resposta do hospedeiro a esses estresses individualmente, há falta de pesquisa sobre as respostas ao estresses abiótico e biótico combinados. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar o transcritôma das raízes da cultivar tolerante a seca Musa acuminata genótipo G-75 em resposta à seca, infecção por M. incognita e a combinação de ambos os estresses “cross-stress”. O RNA total das raízes da cultivar G-075 foi extraído 21 dias após a inoculação com juvenis J2 de M. incognita, após o estresse hídrico, “cross-stress” e de plantas controle não desafiados. A análise fisiológica das plantas revelou estresse hídrico moderado após 14 dias de privação de água, com estresse hídrico severo após 21 dias. Bibliotecas de cDNA representando esse último ponto temporal foram sequenciadas usando a tecnologia Illumina Novaseq 6000 S4. Sequências de alta qualidade foram mapeadas no genoma de referência de M. acuminata spp. malaccensis var. Pahang (versão 4), permitindo a identificação e classificação de genes diferencialmente expressos (DEGs) nos tecidos das raízes parasitadas pelo nematoide, estresse hídrico e ao “cross-stress”, em comparação com a expressão gênica em plantas não estressadas. O sequenciamento gerou um total de 359.425.623 sequências paired-end, com 287.982.958 sequencias mapeadas no genoma de referência. Estas representam um total de 34.317 genes, com 5.090 DEGs identificados entre todos os tratamentos, em comparação com os controles não desafiados. Um total de 573 DEGs foram identificados nas bibliotecas de plantas infectadas por nematoides, em relação aos controles não inoculados. A análise de enriquecimento revelou termos GO sobrerepresentados relacionados à atividade catalítica, atividade oxidoredutase, ligação a carboidratos e ligação a ácidos nucleicos. Em resposta à seca, um total de 2.834 DEGs foram identificados, com termos GO sobrerepresentados incluindo resposta a estímulos, atividade catalítica e ligação a ácidos nucleicos. Em resposta ao cross-stress, um total de 1.683 DEGs foram identificados, dos quais 241 genes eram comuns a todos os estresses. Nessa condição, as categorias GO enriquecidas compreendiam resposta a estímulos, atividade catalítica, atividade oxidoredutase e ligação a ácidos nucleicos. Os genes candidatos regulados positivamente para cada estresse foram validados via RTqPCR para confirmar a tendencia do RNA-seq. Em respostas a M. incognita, genes que codificam NLRs, RLKs, transportadores ABC, bem como, genes envolvidos na produção de calose, vias de auxina, ácido abcisico (ABA) e ácido jasmonico foram regulados positivamente, para o estresse hídrico e o crossstress, DEGs regulados positivamente incluíram aqueles envolvidos em resposta a frio, salinidade, temperatura e lesões, bem como estresse oxidativo, vias de ABA, auxina e etileno. A análise das raízes de uma cultivar tolerante a seca desafiada com a infecção por M. incognita aprimora a compreensão de como a planta responde aos estreses bióticos, abióticos e a combinação deles, fornecendo genes candidatos para o melhoramento genético em Musa para tolerância a múltiplos estresses.

A seca dos ponteiros, doença bacteriana causada por Erwinia psidii, é considerada uma importante doença da cultura da goiabeira (Psidium guajava L.) e do eucalipto (Eucalyptus spp.), chegando a causar entre 30 e 85% de perdas, é um dos principais fatores limitantes da produção. Uma vez que a principal forma de disseminação da doença é através de material vegetal propagativo assintomático, métodos sensíveis, rápidos e acurados para a detecção do patógeno em plantas assintomáticas são necessários para a diagnose precoce. Assim, o objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento de um ensaio de detecção molecular de amplificação isotérmica (LAMP) para detecção de Erwinia psidii na cultura da goiaba e do eucalipto. Em busca de regiões genômicas exclusivas para E. psidii, foi realizada a análise de genômica comparativa com o software RUCS, comparando as sequências do alvo juntamente com as regiões de diversos agentes fitopatogênicos que acometem as culturas da goiaba e do eucalipto. Das 842 regiões exclusivas, somente as cinco com maior potencial foram usadas para o desenho de conjuntos de primers. Além dessas, a região recA, anteriormente usada para o desenvolvimento de primers específicos para PCR convencional e qPCR, também foi selecionada. Os sete conjuntos de primers foram desenhados na plataforma NEB® LAMP Primer Design Tool. A verificação de compatibilidade dos primers foi realizada utilizando o isolado tipo IBSBF435, onde foram avaliadas duas temperaturas (60 e 65 ºC) e seis intervalos de tempo (30, 40, 50, 55, 60 e 75 minutos). A temperatura de 65 ºC, com mudança de cor para quatro dos sete conjuntos, a partir de 50 minutos. Em seguida, foi realizado um ensaio para examinar a proporção entre primers internos e externos para aprimorar o LAMP. A proporção 8:1 (mais diluído) foi capaz de resultar em amplificação três dos quatro conjuntos, enquanto na concentração de 4:1, todos os quatro conjuntos foram capazes de amplificação. A sensibilidade do conjunto de primers mais promissor (Ep19) foi testada com sete diluições do DNA extraído do isolado tipo, entre 10 e 1x10-4 ng.µL-1 . O ensaio alcançou a sensibilidade para detectar até 1x10-3 ng.µL-1 .

A morte descendente causada por Lasiodiplodia spp. tem emergido como uma importante doença na lavoura cacaueira em alguns países produtores. Apesar de não ser registrado para o controle da morte descendente, o princípio-ativo difenoconazol é utilizado na cultura do cacaueiro e as populações de Lasiodiplodia estão expostas à pressão de seleção realizada pelo princípio ativo em campo. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a sensibilidade de isolados de Lasiodiplodia spp. ao difenoconazol e sua influência nos componentes adaptativos. Para isso, foi estimado in vitro a concentração efetiva que resulta em 50% de inibição do crescimento micelial (CE₅₀) de 122 isolados oriundos do Brasil e Equador. Três componentes de adaptabilidade foram avaliados para 11 isolados com valores de CE₅₀ superiores e inferiores a 1 μg ml^-1. Dos 122 isolados, 11,47% apresentaram comportamento não-sensível, com CE₅₀ superior ou igual a 1 μg ml^-1, enquanto os restantes (88,5%) foram sensíveis com uma CE₅₀, inferior a 1 μg ml^-1. Os componentes de adaptabilidade avaliados não apresentaram diferença significativa (Teste t, p=0.05), indicando a ausência de custos adaptativos. Concluiu-se, portanto, que não se detectou isolados considerados resistentes e que não houve custos adaptativos em relação a virulência e taxa de crescimento micelial.

O milho (Zea mays L.) é uma das culturas de grãos mais importantes no mundo, com demanda crescente para alimentação, ração animal, matéria-prima para indústria e produção de etanol (Lappe et al. 2022). O Brasil ocupa a terceira posição entre os maiores produtores de milho, respondendo por 10% da produção global, contudo, sua produtividade (5.495 kg/ha) é significativamente menor quando comparada à produtividade dos EUA (12.344 Kg/ha) (Conab, 2024; USDA, 2024). A baixa eficiência de manejo de pragas e doenças, que causam cerca de 23% de perdas de produtividade mundial, pode ser um dos fatores responsáveis por essa baixa produtividade. No Brasil, até o momento, há o relato de dez espécies de vírus infectando milho (Mar et. al., 2013, Fontenele et al., 2018; Kitajima, 2020). No entanto, apenas cinco dessas espécies têm suas sequências genômicas confirmadas. São elas: maize rayado fino virus - MRFV, gênero Marafivirus (Hammond e Bedendo, 2007), sugarcane mosaic virus – SCMV, gênero Potyvirus (Gonçalves et al., 2011), barley yellow dwarf virus PAV – BYDV-PAV, gênero Luteovirus (Mar et. al., 2013), maize yellow mosaic virus – MaYMV, gênero Polerovirus (Gonçalves et al., 2017; 2020) e maize striate mosaic virus – MSMV, gênero Mastrevirus (Fontenele et al., 2018). Apesar da importância econômica do milho, no Brasil, há uma lacuna nos estudos sobre os vírus que afetam essa cultura (levantamentos de incidência e ocorrência), principalmente devido à falta de métodos padronizados para detecção e identificação dos vírus. Nesse contexto, o presente estudo propõe desenvolver protocolos de detecção para os vírus de milho por RT-PCR e RT-qPCR baseado em SYBR Green, utilizando a base de dados das sequências virais obtidas por high-throughput sequencing (HTS) a fim de garantir a compatibilidade de primers com os isolados circulantes. Amostras de milho de quatro regiões do Brasil foram analisadas por HTS a fim de conhecer a diversidade viral presente na cultura, inclusive potenciais novos vírus ou variantes. A partir desses dados, primers para RT-PCR e RT-qPCR foram desenhados com base nas regiões mais conservadas e controles positivos construídos em plasmídeos pGEM-T Easy e pCR4-TOPO. O resultado do HTS apontou a presença de cinco vírus, dos quais quatro são conhecidos no Brasil (MRFV, SCMV, MaYMV e MSMV) e um trata-se do primeiro relato, um umbravirus-like. Todos foram confirmados por RT-PCR nas amostras individuais de milho. Os primers de RT-qPCR foram testados in silico quanto a especificidade, temperatura de desnaturação e probabilidade de “self-dimer” e “hetero-dimer”. Após confirmação das sequências dos controles positivos por método Sanger, curvas-padrão de RT-qPCR para cada alvo viral foram elaboradas utilizando cinco diluições seriadas, em triplicata, e o número de cópias calculado. O ensaio de RT-qPCR baseado em SYBR Green foi desenvolvido com amostras de campo em triplicata. A análise da curva de dissociação permitiu discriminar os resultados positivos de eventuais amplificações não específicas, pois os amplicons de cada alvo apresentaram temperatura de melting consistente. A especificidade dos primers também foi confirmada pela visualização de bandas nos tamanhos esperados em gel de agarose. A avaliação das amostras juntamente com o uso de controles negativos e controle interno (gene de referência) permitiu a detecção precisa dos alvos. Assim, os protocolos desenvolvidos podem ser usados para detecção dos patógenos (aplicação qualitativa), em estudos de levantamento e incidência dessas viroses, podendo posteriormente ser testados para fins de quantificação de carga viral.

O fungo Sclerotinia sclerotiorum, causador do mofo branco e de doenças de podridão do caule em diversas culturas, é um organismo necrotrófico que utiliza proteínas e metabólitos secretados para matar as células do hospedeiro. Estudos indicam que atualmente existem 425 espécies documentadas como hospedeiras desse fungo altamente destrutivo. Sua sobrevivência ocorre principalmente através de escleródios, agregados de hifas melanizadas que persistem no solo por longos períodos. Os escleródios podem germinar miceliogenicamente ou carpogenicamente, sendo este último o modo dominante de infecção. A disseminação do fungo ocorre por meio de ascósporos transportados pelo vento, resultando em infecções diretas na planta em condições ideais de temperatura e umidade. S. sclerotiorum é conhecido por causar danos significativos às culturas, resultando em perdas econômicas substanciais, especialmente em condições ambientais favoráveis. A falta de resistência total do hospedeiro e a vasta gama de plantas suscetíveis contribuem para os impactos prejudiciais dessa patologia, que podem variar de 35 a 50%, chegando a proporções mais graves de 80 a 100% em situações extremas. A presença de micélio branco nos tecidos afetados é um sinal identificável, mas não há sintomas exclusivos comuns em todos os hospedeiros. A resistência a S. sclerotiorum torna-se crucial, e os parentes silvestres do amendoim surgem como fontes valiosas de genes resistentes a doenças. Essas espécies selvagens, como A. duranensis e A. stenosperma, apresentam altos níveis de resistência a certas doenças, com estudos anteriores prospectando e identificando genes dessas espécies, utilizando abordagem transcriptômica para compreender as respostas a estresses bióticos e/ou abióticos. O presente estudo examinou os efeitos da superexpressão de genes candidatos de espécies selvagens de Arachis, potencialmente envolvidos em respostas de defesa a estresses bióticos. Utilizando Arabidopsis thaliana e Nicotiana tabacum como plantas modelo, o objetivo foi compreender como esses genes influenciam a interação com S. sclerotiorum por meio de avaliações fenotípicas e subsequentes avaliações moleculares. Uma metodologia de inoculação foi inicialmente estabelecida para folhas destacadas, com bioensaios conduzidos utilizando seis genes de ambas A. duranensis e A. stenosperma. O estudo abordou a superexpressão de genes específicos, como AdEXLB8 e AsTIR19, em plantas transgênicas para avaliar sua influência na resistência a S. sclerotiorum. A superexpressão de AdEXLB8 mostrou aumento na tolerância, sugerindo seu potencial como gene candidato para fortalecer a resistência por meio de modificações na parede celular e ativação de vias de sinalização de fitohormônios. A análise de AsTIR19 destacou a complexidade na interação planta-patógeno, revelando insights sobre mecanismos moleculares, como a indução de espécies reativas de oxigênio, e ressaltando a engenharia genética como uma ferramenta promissora para melhorar a resistência. Além disso, AsECHI1 isolado e em combinação com AdEXLB8 resultaram em redução significativa de lesões fúngicas, indicando a eficácia de estratégias piramidais na ampliação do espectro de resistência. Por outro lado, a superexpressão dos transgenes AsAOC3, AsTIL e AsSTS4 não apresentou impacto significativo no progresso da doença, evidenciando a complexidade das interações gene-patógeno e a necessidade de abordagens mais abrangentes. A superexpressão desses genes pode oferecer uma abordagem eficaz no desenvolvimento de variedades resistentes para mitigar as perdas causadas por S. sclerotiorum, destacando a importância da investigação genética e da utilização de parentes silvestres no melhoramento de culturas.

A mancha bacteriana é uma das principais doenças que reduzem a produtividade na cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum L.). As principais medidas de controle da doença fazem o uso de produtos nocivos ao meio ambiente, além de aumentar o custo de produção. Dessa maneira, este estudo objetivou desenvolver estratégiasinovadoras de controle que driblam essas dificuldades. Nesse sentido, estudou-se a expressão de genes relacionados com a suscetibilidade do tomateiro a Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans (Xep), bem como o silenciamento do gene Transcription initiation factor IIA subunit 2 (gamma) (SlTFIIAγ) por meio de ASO (short antisense deoxyoligonucleotide). Os resultados de silenciamento do gene SlTFIIAγ demonstraram que o tratamento com ASO promoveu melhor desempenho das plantas desafiadas com Xep, e portanto, esse gene foi selecionado para avaliação do nocaute por meio de CRISPR/Cas9. O nocaute revelou que houve a edição gênica em sete linhagens T0, sendo cinco apresentando mutações bialélicas e duas quiméricas. Outra estratégia de controle estudada foi a superexpressão em tomateiro de um gene de defesa de Brassica oleracea que codifica para endoquitinase. As plantas transgênicas T2 foram submetidas a um ensaio de resistência a Xep, mas não foi possível observar resistência. Adicionalmente, as plantas foram desafiadas com o fungo Sclerotinia sclerotiorum, e foi observado que dois eventos de transformação demonstraram maior capacidade de suportar o crescimento inicial do fungo. Isso pode estar relacionado com a ação da quitinase na parede celular fúngica. Além disso, o trabalho buscou por novos potenciais genes relacionados com a suscetibilidade por meio de uma abordagem proteômica. Foram identificadas nove proteínas que potencialmente contribuem para o desenvolvimento da doença. As proteínas diferencialmente abundantes foram principalmente relacionadas com o transporte de açúcar, resposta ao estresse e geração de metabólitos e energia. O aprofundamento do estudo destas proteínas poderá proporcionar novos alvos para silenciamento e/ou nocaute gênico visando a resistência a mancha bacteriana.

A raiz rosada é a principal doença do alho e da cebola em plantios realizados em períodos de escassez hídrica e temperaturas elevadas, e/ou áreas com cultivos sucessivos de aliáceas. Embora a etiologia da raiz rosada não seja completamente esclarecida, os fungos habitantes do solo, Setophoma terrestris e Fusarium spp., são frequentemente associados com essa doença. Além dessa incerteza, vários estudos abordam visões conflitantes em relação a formação de clamidósporos e microescleródios em S. terrestris. Como o sequenciamento de populações e de genomas de diferentes espécies fúngicas revelam relações filogenéticas e adaptações ao ambiente, os objetivos desse estudo foram: (i) esclarecer a etiologia da raiz rosada do alho e da cebola; (ii) avaliar a patogenicidade dos isolados de Setophoma e Fusarium em raízes de alho e de cebola; (iii) avaliar a patogenicidade dos isolados de Fusarium spp. e Neocosmospora spp. em bulbos de alho e de cebola; (vi) sequenciar e anotar o genoma de S. terrestris usando as plataformas Illumina^® (short reads) e PacBio^® (long reads) e; (vii) identificar in silico os clusters de genes de biossíntese PKS relacionados à patogenicidade de S. terrestris. Os isolados foram obtidos de raízes de aliáceas e gramíneas com coloração púrpura intensa em sete estados brasileiros. O sequenciamento parcial do gene β-tubulina foi realizado para todos isolados enquanto isolados representativos foram selecionados para os testes de patogenicidade e a caracterização morfológica. A comparação de sequências do gene β-tubulina revelaram um clado de Setophoma (n=50) e dez clados de Fusarium/Neocosmospora (n=31). Os sintomas da raiz rosada foram visualizados em raízes de alho e cebola inoculadas com Setophoma enquanto raízes inoculadas com diferentes isolados de Fusarium permaneceram assintomáticas. A análise multigênica dos isolados patogênicos confirmaram somente S. terrestris causando raiz rosada em alho e cebola. Além disso, novos hospedeiros de S. terrestris foram relatados no Brasil. Como não se observou a formação de clamidósporos e microescleródios em S. terrestris, conclui-se que a presença de picnídios em raízes de várias hospedeiras e restos culturais são a única fonte de inóculo da raiz rosada.  Para compreender a diversidade de espécies de Fusarium e Neocosmopora associadas com a raiz rosada, isolados representativos foram inoculados em bulbos e identificados por análise multigênica de sequências parciais dos genes fator de elongação e RNA Polimerase II. Entre as dez espécies de Fusarium/Neocosmopora (F. acutatum, F. annulatum, F. elaeidis, F. fabacearum, F. lacertarum, F. languescens, F. nirenbergiae, N. bostrycoides, N. falciformis e N. solani), somente F. acutatum e F. languescens não causaram a podridão basal em bulbos de alho e cebola. O genoma de S. terrestris foi sequenciado e anotado, resultando em uma montagem de 47 Gb, na qual foram preditos 54 genes de biossíntese. A anotação dos genes de biossíntese PKS foi relacionada com fitotoxidez e micotoxidez em diferentes patossistemas, podendo ser importante no processo infeccioso de S. terrestris. As novas informações obtidas nesse estudo são fundamentais para melhoristas e fitopatologistas no desenvolvimento de genótipos de alho e cebola resistentes a raiz rosada, auxiliando no manejo eficiente da doença no campo.

Bactérias fitopatogênicas são organismos procariotos capazes de causar sérios prejuízos em diversas culturas de importância econômica mundialmente, dentre elas, o tomateiro (Solanum lycopersicum). O cultivo do tomate ocupa extensa área no Brasil e com 51. 452 hectares plantados e uma produção estimada em 3,9 milhões de toneladas de tomate no ano de 2023, o país é o oitavo maior produtor mundial. A Região Integrada de Desenvolvimento do Distrito Federal e Entorno (RIDE-DF) que engloba áreas do Distrito Federal, Goiás e Minas Gerais, corresponde à 10,78% da produção nacional do fruto em uma área de 4.774 hectares com cerca de 74,28% da produção destinada à indústria. Dentre as fitobacterioses que afetam a cultura, a mancha bacteriana do tomateiro (Mab) causada por três espécies de Xanthomonas, dentre elas X. euvesicatoria pv. perforans – Xep, é uma das doenças foliares mais importantes. Seu manejo é realizado de modo integrado, utilizando diferentes métodos de controle, como o químico e biológico. Porém, para o controle químico é preocupante a possibilidade da redução de sua eficiência em função da emergência de populações resistentes aos produtos, incluindo os de ação multissítio. Esses efeitos indesejados podem estar relacionados a um fenômeno conhecido como efeito hormese. Este efeito é caracterizado por inibição e estímulo de alguma característica do organismo, pela exposição a altas e baixas concentrações, respectivamente, de um agente tóxico. Deste modo, doses subinibitórias para os patógenos podem conduzir a estímulos com aumentos quantificáveis na severidade e incidência de doenças. Os impactos potenciais desse efeito ainda são pouco conhecidos e explorados na fitopatologia, mas estudos recentes têm demonstrado o seu potencial para aplicação comercial na agricultura. Uma dessas aplicações seria no aprimoramento do controle biológico de doenças. Espécies de Bacillus são agentes de biocontrole amplamente utilizadas em formulações comerciais por possuir boa habilidade de manutenção nos agroecossistemas. Cinco diferentes produtos comerciais à base de Bacillus spp. são registrados para a cultura do tomateiro, dentre eles: Serenade (B. subtilis QST 713) e Duravel (Bacillus amyloliquefaciens MBI600). Assim, buscou-se com este trabalho investigar a ocorrência de isolados resistentes em uma população de 45 isolados de Xep, a espécie predominante no DF e Entorno, bem como a ocorrência do efeito hormese, pelo uso de doses subinibitórias de cobre, seus efeitos sobre o crescimento e formação de biofilme, efeitos do precondicionamento à uma subdose e efeitos de subdoses na virulência do patógeno, bem como na otimização do controle biológico da mancha bacteriana do tomateiro com diferentes isolados comerciais de Bacillus spp. Verificou-se que o gene copA está presente em Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans (Xep) e pode conduzir a expressão resistência ao cobre. Um efeito estimulatório ou tipo-hormese por doses subinibitórias de cobre ocorre em Xep sem relação com isolado ou gene de resistência e leva a aumentos significativos no crescimento e produção de biofilme bacteriano. Doses que são estimulatórias a uma determinada característica da bactéria in vitro podem não ser estimulatórias a outro parâmetro, tal como a virulência de um mesmo isolado, demonstrada neste estudo. Bacillus spp. não apresenta compatibilidade com o cobre in vitro em doses acima da CMI, enquanto doses abaixo da CMI induzem resposta estimulatória aumentando o crescimento da bactéria. Aplicações de Bacillus spp. no controle biológico da Mab não reduzem a severidade da doença em aplicações via foliar ou drench e o cobre estimulatório in vitro a Bacillus subtilis, não tem efeito aditivo no controle da doença.

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é a hortaliça de maior importância socioeconômica mundial. A constante movimentação do solo, a disponibilidade de adubos químicos e orgânicos, o uso de irrigação e os espaçamentos adotados nos campos de tomateiro favorecem a emergência de plantas daninhas que competem por água, luz e nutrientes. Além disso, as plantas daninhas podem funcionar como hospedeiras alternativas de pragas e patógenos que afetam a cultura. Dentre estes patógenos estão os vírus do gênero Begomovirus (família Geminiviridae) que apresentam genoma de DNA circular de fita simples, classificados como monopartidos (= Velho Mundo) ou bipartidos (= Novo Mundo). O complexo de espécies crípticas de Bemisia tabaci é responsável pela transmissão dos begomovírus, sendo B. tabaci Middle East Asia Minor 1 – MEAM 1(= biótipo B) e B. tabaci Mediterranean – MED (= biótipo Q), as mais importantes. Os begomovírus apresentam um número expressivo de espécies descritas e diversas outras em fase caracterização, se configurando como o maior grupo de vírus vegetais. Os mecanismos de mutação, recombinação e pseudorrecombinação estão intimamente relacionadas a alta diversidade apresentada pelo gênero Begomovirus. O uso de HighThrougput Sequencing (HTS) tem constituído importante ferramenta no estudo de populações virais, contribuindo com informações ecológicas e epidemiológicas de grande relevância. Neste contexto, o presente trabalho buscou realizar (via HTS) um amplo levantamento e caracterização da diversidade viral de membros da família Geminiviridae associados a plantas daninhas presentes em cultivos de tomateiro no Brasil. Para tal finalidade foi estabelecido um pool de amostras de plantas das famílias Fabaceae (23 amostras) e Solanaceae (64 amostras). As amostras foram enriquecidas com DNA circulares por meio de Rolling Circle Amplification (RCA) e submetidas a etapa de sequenciamento HTS pela plataforma Illumina NovaSeq-6000. As sequências obtidas foram convertidas em contigs com o auxílio do software CLC Genomics 7.5, analisadas no Geneious R11.1 e comparadas com o banco de sequências disponíveis no GenBank por meio do algoritmo BLASTn. Doze genomas virais foram recuperados, dos quais sete begomovírus conhecidos, dois vírus pertencentes ao gênero Topilevirus, um agente subviral pertencente ao gênero Alphasatellite e outro ao gênero Gemycirculavirus. Além disso, uma potencial nova espécie de Begomovirus também foi recuperada. O uso de primers espécieespecíficos em reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) permitiu a recuperação dos genomas em amostras individuais. Para identificação botânica precisa das hospedeiras foram utilizados primers direcionados aos genes rbcL (ribulose-1,5-bisfosfato) e matK (maturase K), o que levou ao reconhecimento de duas novas hospedeiras de tomato severe rugose virus (ToSRV), quatro novas hospedeiras de Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), três novas hospedeiras de Sida micrantha mosaic virus (SimMV) e oito novas hospedeiras de tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV), evidenciando a diversidade viral existente entre plantas daninhas e a atuação destas plantas como reservatórios virais em áreas próximas aos cultivos de tomateiro. Em pool composto por 78 amostras da família Malvaceae (submetido ao mesmo conjunto de análises), o emprego primers espécie-específicos para os componentes de DNA-A e DNA-B de EuYMV, permitiram a identificação de três novas hospedeiras virais dentro desta família botânica, além de uma nova hospedeira da família Fabaceae. Esses resultados reforçam a importância destas plantas para o ciclo epidemiológico dos begomovírus e aponta a presença de EuYMV em hospedeiras alternativas em novas áreas. No último capítulo, através dos resultados obtidos nesta tese e empregando um levantamento de publicações disponíveis nos últimos anos, foi traçado um panorama que permite avaliar a distribuição de espécies de Begomovirus bem como uma listagem atualizada hospedeiras das famílias Fabaceae e Solanaceae no território brasileiro.

Os nematoides-das-galhas (NGs), Meloidogyne spp. são considerados importantes patógenos da cultura do café, que podem limitar a produção e causar perdas econômicas. Meloidogyne izalcoensis foi recentemente detectada no Brasil, parasitando cafeeiros no Triângulo Mineiro, MG. Os objetivos desta pesquisa foram: (i) investigar a ocorrência e distribuição de Meloidogyne spp. em cafezais presentes no Triângulo Mineiro, com ênfase em M. izalcoensis, comparando as técnicas de eletroforese de isoenzimas (α-esterases) e marcadores moleculares específicos (SCAR-PCR-café), (ii) estudar a diversidade e filogenia de populações brasileiras e estrangeiras de M. izalcoensis, usando marcadores RAPD, AFLP, ITS, D2D3, COII e Hsp90, (iii) avaliar a reação de suscetibilidade ou resistência de cultivares de cafeeiros disponíveis no Brasil a M. izalcoensis, e (iv) analisar a reação de hospedabilidade de diferentes espécies botânicas a M. izalcoensis. Nos levantamentos realizados foram identificadas as espécies: M. exigua (41,67%), M. incognita (33,33%), M. paranaensis (20,83%) e M. izalcoensis (4,17%), mostrando que as ferramentas moleculares são adequadas para a identificação das espécies isoladas ou em misturas. Populações de espécies de Meloidogyne em mistura foram observadas em 20,83% das amostras. O uso de marcadores SCAR provou ser a ferramenta mais eficaz para identificar com precisão M. exigua e espécies mistas. Essa pesquisa confirma que M. izalcoensis tem sua ocorrência restrita na região onde foi inicialmente detectada. Baseado nos marcadores moleculares com amplificação aleatória (RAPD) e polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (AFLP), uma baixa variabilidade intraespecífica foi detectada entre populações de M. izalcoensis da África, Benim, Brasil e El Salvador. Filogeneticamente, todas as populações de M. izalcoensis de diferentes localidades (El Salvador, Quênia, Tanzânia, Vietnã e Brasil) foram agrupadas com 90% e 69% de suporte bootstrap para as regiões COII e HSP90, respectivamente, indicando que essas regiões são altamente conservados para a espécie. Além disso, ambos os marcadores permitiram a separação de populações de M. izalcoensis de outras importantes espécies de Meloidogyne do café, incluindo M. exigua, M. paranaensis, M. incognita, M. arabicida e M. lopezi. Nos estudos de resistência, a maioria dos genótipos testados portadores de resistência a outras espécies de Meloidogyne (Amphillo × Catuaí, Híbrido de Timor, IAPAR 59, IPR 99, IPR 100, IPR 102, IPR 103, IPR 105, IPR 106, IPR 107 e IPR 108) foram considerados suscetíveis a M. izalcoensis, exceto o porta-enxerto cv. Apoatã IAC 2258, que se mostrou moderadamente resistente, com segregação genética de 43,8% para este caráter. Nos ensaios de hospedabilidade, a maioria das espécies botânicas avaliadas foram classificadas como não hospedeiras ou má hospedeiras para M. izalcoensis: algodão, arroz, feijão, aveia branca, aveia preta, azevém, milho, três espécies de gramíneas, duas cultivares de milheto, duas cultivares de trigo, Crotalaria breviflora, C. ochroleuca, C. spectabilis, feijão-deporco, mucuna-cinza e duas espécies de capim-arroz. Apenas o tomateiro e o feijoeiro foram classificados como boas hospedeiras, e C. juncea e soja foram classificadas como hospedeiras intermediárias. As plantas identificadas como não-hospedeiras e máshospedeiras podem ser recomendadas para culturas intercalares ou em rotação de culturas em áreas infestadas por M. izalcoensis.

Begomovirus (família Geminiviridae) corresponde ao maior gênero de vírus de plantas, englobando vírus que possuem uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, encapsidados separadamente em partículas de 18-30 nanômetros. Isolados com genoma bipartido (apresentando os componentes DNA-A e DNA-B) predominam em tomateiro no Novo Mundo. Os begomovírus são transmitidos com grande eficiência pelo vetor Bemisia tabaci Middle East Asian Minor 1 – MEAM-1 (= biótipo B), que se encontra amplamente distribuído, apresentando hábito alimentar polífago e alta adaptabilidade a diferentes condições ambientais. A introdução de B. tabaci MEAM 1 no início da década de 1990 foi o fator desencadeador de epidemias de begomoviroses em tomateiro no Brasil, com subsequente aumento no número de relatos de novas espécies virais. Além disso, padrões distintos de diversidade e dinâmica de subpopulações virais foram observados em diferentes ambientes. Neste cenário, as plantas daninhas apresentam papel relevante por funcionarem como reservatórios naturais de begomovírus. Novas espécies virais têm sido relatadas em plantas daninhas, incluindo áreas dentro e no entorno de campos comerciais de tomateiro. Alguns begomovírus de plantas daninhas têm sido identificados e caracterizados biologicamente, entretanto acredita-se que estes estudos não tenham sido extensos o suficiente para estimar a real diversidade de novas espécies em plantas daninhas. No país, quatro begomovírus foram relatados infectando concomitantemente o tomateiro e plantas daninhas. A nível global, mais de 40 begomovírus foram descritos em espécies de Malvaceae, sendo que alguns destes foram detectados infectando originalmente espécies de Solanaceae. O genoma pequeno e bipartido somado a eficiência de transmissão e polifagia do vetor propiciam condições favoráveis para a ocorrência de infecções mistas e de eventos de recombinação e pseudorecombinação entre begomovírus, contribuindo assim, para a frequente alteração da estrutura genética das populações virais nas nossas condições. Diferentes estratégias têm 3 sido empregadas para analisar os processos evolutivos capazes de moldar a estrutura genético-molecular dos begomovírus. A principal delas tem sido a obtenção do genoma viral completo (DNA–A e DNA–B) para posterior análise através do uso de diferentes programas e modelos evolutivos. A metagenômica aliada ao High Throughput Sequencing tem permitido determinar uma grande diversidade viral presente no Brasil. Uma grande frequência de infecções mistas vem sendo detectada com muitas delas envolvendo potenciais espécies novas capazes de induzir sintomas severos em plantas. No presente trabalho, quatro contigs provenientes de HTS de amostras foliares de Malvaceae foram selecionados para estudo e caracterização, conforme metodologia realizada pela equipe do LVV-Fito e resumida a seguir. Inicialmente, amostras foliares de plantas daninhas exibindo sintomas típicos de begomovírus (clorose generalizada, mosaico e pontuações cloróticas) foram coletadas em áreas de produção de tomate e/ou áreas próximas ao cultivo de tomateiro, nas cinco regiões do país. As amostragens foram realizadas no período de 2001 a 2020, sendo analisado um total de 78 amostras foliares de plantas da família Malvaceae (selecionadas usando como critérios ano/local de coleta). O DNA total foi extraído via CTAB e solventes orgânicos e armazenado a -20 °C. A confirmação inicial da presença de infecção por begomovírus nas amostras foi feita por meio de ensaios de PCR (reação em cadeia da polimerase) usando primers degenerados ‘PAR1c496’ e ‘PAL1v1978’. O DNA circular viral foi enriquecido nas amostras positivas via amplificação por círculo rolante (RCA). O sequenciamento de alto rendimento (HTS) foi realizado em uma plataforma Illumina HiSeq2500. Os contigs virais foram anotados e as leituras foram mapeadas de volta ao genoma anotado usando a ferramenta ‘Map to reference’ disponível no programa Geneious 11.1.5. Cerca de 7.391.728 milhões de leituras foram obtidas do pool de 78 amostras. Após a montagem, no programa CLC Genomics Workbench 11, foram obtidos 10.679 contigs. Quatro contigs foram selecionados. Três destes contigs correspondiam ao DNA–A completo e exibiram níveis de identidade inferiores a 91%, consistentes com o critério taxonômico atual de definição de novas espécies dentro do gênero Begomovirus. O componente DNA–A da potencial espécie nova #1 apresentou 79% de identidade com Sidastrum golden leaf spot virus (HM357458), a espécie nova #2 apresentou a identidade de 81% com Oxalis yellow vein virus (KM887907), enquanto a nova #3 apresentou a identidade de 78% com Sida yellow mosaic Alagoas virus (JX871383), confirmando a ocorrência de três novas espécies de begomovírus nas plantas daninhas. Os componentes DNA – B foram recuperados e as análises realizadas, incluindo a confirmação de cognatos. O quarto contig apresentou identidade de 98,24% com Sida micranta mosaic virus (SiMMV) (KC706535). Após uso de primers específicos, já disponíveis, obteve-se um resultado de 41 amostras positivas para SiMMV A caracterização destas três espécies, bem como a ocorrência e distribuição de Sida micranta mosaic virus nas cinco regiões brasileiras serão apresentados na presente dissertação.

Os vírus são entidades biológicas comuns em todos os ambientes terrestres, mas pouco se sabe sobre. A avaliação é de que o conhecimento sobre a virosfera eucariótica total seja inferior a 1%. A maior parte da informação está restrita a vírus que causam doenças e perdas econômicas. Outras relações ecológicas e descrição de espécies crípticas de vírus continuam praticamente inexploradas. O segmento de estudo sobre vírus de plantas não é distinto. A compreensão da diversidade, forças evolutivas e seu impacto é desconhecida. No entanto, com o advento do High throughput sequencing (HTS), o estudo do viroma tornou-se tangível e de rápido crescimento. Da mesma forma, as ferramentas de bioinformática melhoraram a compreensão da diversidade viral e dos padrões de evolução. Com a pandemia de SARSCoV 2 e o possível surgimento de novas doenças virais em humanos e em outros eucariotos, é notório a necessidade da exploração e a geração de novas informações sobre a virosfera terrestre. A família Orchidaceae é a segunda maior família de plantas que florescem. Eles crescem predominantemente em áreas tropicais, assim como as espécies da família Bromeliaceae. Os estudos sobre diversidade viral de ambas as famílias são escassos, exceto para as plantas de interesse econômico. Ainda assim, diante de outras espécies economicamente importantes, o volume de pesquisa é incipiente. Neste trabalho, a bioprospecção de viromas foi realizada com espécimes da família Bromeliaceae e Orchidaceae encontradas em cultivos e reservas ecológicas privadas no planalto central. O HTS de DNA e de RNA dessas plantas foram feitos utilizando a plataforma Illumina NovaSeq 6000 e HiSeq 2000, respectivamente. Programas de bioinformática, CLC Genomic Workbench v. 20.0 e Geneious R11.1, foram utilizados para estudar os resultados encontrados no viroma. Dois novos vírus de DNA e sete de RNA foram descritos infectando orquídeas e bromélias. No primeiro capítulo uma revisão bibliográfica sobre o mercado de plantas ornamentais e sobre a incidência de viroses sobre nelas foi desenvolvida com 2 o intuito de explorar o status quo das pesquisas na área. No segundo capítulo a exploração dos resultados de HTS de RNA de 54.088.166 reads e 16.560 contigs foi feita com o intuito de caracterizar os possíveis vírus de RNA presentes. Para isso, os contigs obtidos foram confrontados contra um banco de dados de sequências virais via BLASTn. 15 sequências virais de RNA, até então não caracterizadas foram identificadas. Ao total sete novas espécies virais foram caracterizadas. Sendo uma sequência pertencente ao gênero Alphaendornavirus (família Endornaviridae), duas pertencentes ao gênero Totivirus (família Totiviridae), três pertencentes ao gênero Polerovirus (família Solemoviridae), dois RNA 1 e dois RNA 2 pertencentes ao gênero Dichorhavirus (família Rhabdoviridae) e um RNA 1 e um RNA 2 pertencente ao gênero Nepovirus (família Secoviridae). Três sequencias de RNA 1 relacionados ao gênero Sadwavirus, família Secoviridae, foram identificados. Entretanto, nenhum RNA 2 foi encontrado. De acordo com os critérios de classificação de gênero adotados pelo International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), as informações encontradas dessas três sequências são insuficientes para estabelecer novas espécies. As sete novas espécies foram nomeadas de Alphaendornavirus monocotyledonae (OQ866133); Dichorhavirus monocotyledonae (OQ866129, OQ866130, OQ866131, OQ866132); Nepovirus monocotyledonae (OQ866134, OQ866135); Polerovirus monocotyledonae 1 (OQ866138); Polerovirus monocotyledonae 2 (OQ866139, OQ866140); Totivirus monocotyledonae 1 (OQ866136); Totivirus monocotyledonae 2 (OQ866137). No terceiro capítulo, encontra-se o prefácio dos locais de coleta, da catalogação de amostra e das metodologias empregada nos capítulos subsequentes, o quarto e o quinto capítulo, em que os 11.060.510 reads e 163.808 contigs de HTS são trabalhados. O quarto capítulo é uma Disease note de infecção mista de dois begomovírus conhecidos, o tomato severe rugose virus (ToSRV) e o tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV), em orquídeas do gênero Dendrobium. O quinto capítulo é uma caracterização de dois patógenos altamente divergentes, pertencentes ao gênero Geminiviridae, infectando orquídeas do gênero Spathoglottis. As duas novas sequências virais, 3 denominadas Spathoglottis-associated mottle virus 1 (OQ791967) e Spathoglottis-associated mottle virus 2 (OQ791968), devem ser consideradas novas espécies. Primers foram desenhados para ambas as sequências e confirmaram a infecção em amostras de orquídeas do gênero Spathoglottis.

Os nematoides-das-galhas (Meloidogyne spp.) representam um dos mais importantes grupos de patógenos radiculares devido aos danos induzidos em uma ampla gama de hospedeiras. O parasitismo por Meloidogyne spp. é um grande obstáculo na produção de cenoura (Daucus carota) em regiões subtropicais, causando perdas de produção e qualidade. No Brasil, as espécies com maior importância na cenoura são M. javanica e M. incognita. A cultivar ‘Brasília’ é a principal fonte de resistência contra estas duas espécies. No entanto, ainda não estão disponíveis sistemas de marcadores moleculares ligados aos fatores de resistência para as cultivares brasileiras de cenoura, que facilitaria o processo de seleção. O tomateiro (Solanum lycopersicum) também é severamente afetado por Meloidogyne spp. com especial destaque para M. enterolobii devido a sua recente expansão geográfica e pela capacidade de “quebrar” a resistência conferida pelo gene Mi-1.2. Todavia, fontes alternativas de resistência no tomateiro a M. enterolobii ainda não estão disponíveis. Ademais, novas metodologias de avaliação nematológicas são necessárias para os processos de seleção de plantas resistentes em ambas as hortaliças. Neste contexto, o presente trabalho objetivou estudar diferentes aspectos das interações de cenoura e tomateiro com espécies de Meloidogyne. Em cenoura, realizou-se um estudo com uma população F2 de 108 plantas da cultivar ‘Brasília #83147’ (que segrega para resistência contra M. javanica). Plantas foram inoculadas com 8000 ovos + eventuais J2 de M. javanica aos 30 dias após a semeadura. DNA total foi extraído de amostras foliares e avaliadas (via PCR) com marcadores do tipo SCAR/STS codominantes (SQ1850R / SQ1700S e SQ6650R / SQ6590S) previamente identificados em estreita ligação com um locus de resistência a M. javanica (Mj-1) em ‘Brasília’. Quanto as análises nematológicas, avaliou-se os sistemas radiculares de plantas individuais aos 120 dias após a inoculação (DAI) quanto ao fator de reprodução (FR = pf/pi) e a quantificação individual de galhas e massas de ovos. Raízes de plantas individuais contrastantes (resistentes e suscetíveis) foram vernalizadas e submetidas a autofecundação (geração S1). O bioensaio de inoculação em conjunto com a análise de marcadores confirmou que a resistência não está fixada nessa população, com muitos indivíduos suscetíveis sendo detectados. No entanto, foi possível identificar indivíduos com resistência extrema (resposta do tipo imunidade) e com a presença dos marcadores SCAR/STS codominantes. Esses indivíduos podem ser agora utilizados com parentais para facilitar estudos genéticos bem como o desenvolvimento de novas cultivares brasileiras de cenoura. Além disso, a escala proposta se apresentou mostrou uma ferramenta de interesse, sendo de fácil e rápida utilização para avaliação de germoplasma. Em tomate, foi avaliado o comportamento de 24 acessos do germoplasma sob diferentes níveis de inóculo de M. enterolobii. O potencial efeito residual do gene Mi-1.2 também foi estudado em ensaios comparativos empregando linhagens isogênicas (isolinhas) contrastantes para esse fator de resistência: ‘Rio Grande’ (mi-1.2/mi-1.2) versus ‘Nemadoro’ (Mi-1.2/Mi-1.2). A condição alélica de cada planta individual foi confirmada via utilização de marcadores moleculares ligados ao locus Mi-1.2. Esse marcador molecular também foi empregado para avaliar a utilização desse gene no panorama varietal brasileiro. Os acessos foram inoculados com quatro níveis de inóculo de M. enterolobii (1000, 2000, 4000 e 8000 ovos + eventuais J2s) aos 15 dias após o transplantio. Quanto as análises nematológicas, as raízes do tomateiro aos 45 dias após a inoculação foram avaliadas de acordo com o índice de galhas (IG), índice de massa de ovos (IMO), número de ovos por grama de raiz (NOGR) e o fator de reprodução (FR). Todos os acessos de tomateiro avaliados apresentaram respostas de suscetibilidade, sendo imprescindível conduzir avaliações mais amplas de coleções de germoplasma em busca de fontes de resistência contra esse patógeno emergente. Por sua vez, o gene Mi-1.2 não conferiu efeito residual significativo contra M. enterolobii, pois embora extremamente efetivo contra pelo menos 13 espécies de Meloidogyne, não se mostrou capaz de interferir no processo de infecção deste nematoide. No processo de inoculação de M. enterolobii, os níveis de inóculo mais adequados variaram de 1000 a 2000 ovos + eventuais J2 para a obtenção da máxima manifestação dos caracteres nematológicos. Diante da importância do tomateiro e da cenoura no Brasil, os resultados deste estudo contribuem substancialmente para os programas de melhoramento visando o desenvolvimento de cultivares resistentes as diferentes espécies de Meloidogyne.

O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma das hortaliças mais importantes tanto economicamente quanto socialmente para o Brasil. Os custos de produção e os níveis de produtividade dessa cultura sofrem oscilações recorrentes devido a diversos fatores, dentre eles se destacam as doenças tais como as begomoviroses (causadas por um complexo de espécies de begomovírus). Esses patógenos possuem uma ou duas moléculas de DNA circular de fita simples, encapsidados separadamente em partículas de 18-30 nanômetros. Begomovírus de genoma bipartido (apresentando os componentes DNA–A e DNA–B) predominam em tomateiro no Novo Mundo, sendo transmitidos por diferentes espécies crípticas do complexo Bemisia tabaci. Esses vetores apresentam hábitos alimentares polífagos apresentando extenso círculo de hospedeiras, incluindo diversas plantas daninhas. A introdução de B. tabaci Middle East Asia Minor 1 – MEAM-1 (= biótipo B) se deu no início da década de 1990, desencadeando epidemias de begomoviroses em tomateiro, com aumento exponencial no número de espécies de Begomovirus. A presença de plantas daninhas, principalmente da família Solanaceae, apresenta um papel de grande importância como reservatório de begomovírus que afetam o tomateiro. Novas espécies virais têm sido relatadas em plantas daninhas, sendo que tais interações propiciam a ocorrência de mecanismos naturais geradores de variabilidade genética, que podem levar à geração de novas variantes virais. O advento da tecnologia de High Throughput Sequencing (HTS) tem proporcionado a descoberta de novas espécies virais associadas com o cultivo do tomateiro. Neste contexto, o presente trabalho tem como um dos objetivos estudar a diversidade viral no tomateiro e plantas daninhas da família Solanaceae. Cento e trinta e cinco (135) amostras foliares de tomateiro e plantas daninhas exibindo sintomas típicos de begomovírus (clorose apical, mosaico dourado e pontuações cloróticas) foram coletadas nas regiões Norte (15), Nordeste (43), Sul (11), Centro Oeste (45), Sudeste (18) e Uruguai (3). As coletas foram realizadas no período de 2003 a 2022, sendo analisadas amostras foliares de S. lycopersicum (92), S. aethiopicum (4), S. paniculatum (3), S. sessiliflorum (1), S. melongena (4), S. mammosum (1), espécies de Capsicum (12), Nicandra physalodes (8), espécies de Physalis (6), S betaceum (2), S. viarum e (1) S. americanum (1). As amostras coletadas foram selecionadas usando como critérios ano/local de coleta. O DNA total extraído foi usado como molde para amplificação por círculo rolante (RCA). Inicialmente, a RCA de cada amostra foi utilizada para confirmação da presença de begomovírus por meio de ensaios de PCR usando primers degenerados para o DNA–A (PAR1c496 e PAL1v1978) e para o DNA–B (PBL e CRC). Após esta etapa, RCA das 135 amostras foram empregadas para formar um pool e sequenciadas em uma plataforma Ilumina NovaSeq 6000. Foram obtidos 19.735.294 milhões reads. Esses reads foram usados para montagens dos contigs no CLC Genomics Workbench 11. Foram obtidos 41.659 contigs sendo que 173 deles exibiram após análises com RefSeqViral identidades com begomovírus (170), topilevírus (1) gemycircularvírus (1) e um alfasatélite. Dezesseis dos 170 contigs de begomovírus apresentaram identidade nucleotídica abaixo de 91%, sendo consistentes com o critério taxonômico atual de definição de novas espécies dentro do gênero Begomovirus. Os contigs C195, C18367 e C2046 apresentaram identidades de 99,1%, 99,67% e 99,92% com tomato apical leaf curl virus (ToALCV; MH539677), plant associated genomovirus 12 (MT214094) e espécies de Alphasatellitidae (MT214093), respectivamente. Com exceção de ToALCV, os outros vírus serão futuramente caracterizados de forma biológica e molecular. Outros três contigs foram considerados potenciais espécies dentro do gênero Begomovirus. Estes três contigs C16, C21 e C230 apresentaram 80%, 94% e 80% de identidade com Melochia mosaic virus (KT201151), tomato bright yellow mottle virus (KC791691) e ToBYMV (KC791691), respectivamente. O alinhamento entre os contigs C16, C21 e C230 mostrou uma organização genômica típica de begomovírus bipartidos e foram denominados como potenciais espécies novas. A região comum foi determinada e análises de iterons e outros motivos confirmaram vírus cognatos. Por outro lado, o contig C21 apresentou organização genômica típica de begomovírus monopartido, representando também uma potencial nova espécie viral. A partir da utilização de HTS foi possível observar a presença de altos níveis de variabilidade genética e de diversidade de begomovírus em membros da família Solanaceae, indicando um relevante papel como reservatórios virais. Ações de pesquisa estão sendo conduzidas visando a produção de clones infecciosos para desvendar gama de hospedeiras bem como fontes de resistência contra esses novos vírus.

Durante seu ciclo de vida, as plantas enfrentam diversos fatores limitantes à sua produção, podendo estes serem de origem abiótica ou biótica, ocorrendo isolados ou simultaneamente. Visando refrear ou impedir o avanço prejudicial de tais fatores, os vegetais possuem um sistema imune que sinaliza possíveis ameaças e ativa diferentes tipos de respostas, como a produção de espécies reativas de oxigênio, transcrição de genes estresse-específicos, entre outros. A seca e os nematóides são restrições à agricultura global que podem ocorrer simultaneamente. A banana (Musa spp.), embora esteja entre as frutas mais consumidas no mundo, é suscetível tanto ao estresse hídrico nas áreas afetadas, quanto à infecção pelo nematóide endoparasita Meloidogyne incognita. Por outro lado, favorecidos por eventos evolutivos, os fitopatógenos adquiriram ao longo do tempo, a capacidade de burlar tais respostas, ou ainda, induzir o hospedeiro a produzir compostos que irão favorecer o processo infeccioso. Os nematoides-das-galhas, polífago e amplamente disperso, injeta na célula hospedeira efetores que irão atuar em diferentes níveis no sistema imune vegetal, impedindo que as respostas de defesa sejam ativadas. O objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta do transcritoma radicular no genótipo G075 de Musa acuminata tolerante à seca durante as respostas à seca, infecção por M. incognita e durante estresses cruzados abiótico e biótico combinados; além disso, após identificar genes possivelmente efetores relevantes ao parasitismo de M. incognita, estes foram validados por meio da tecnologia de RNA interferente em plantas de tabaco transgênicas. Amostras de RNA total de raízes foram extraídas de G-075 21 dias após somente inoculação com juvenis J2 de M. incognita, após déficit hídrico, após estresse biótico e abiótico combinados, ou controle não estressado. As bibliotecas de cDNA foram sequenciadas em pares usando a tecnologia lllumina NovaSeq 6000 S4. Sequências de alta qualidade foram mapeadas contra o genoma referência M. acuminata ssp. malaccensis var. Pahang (versão 4), com genes diferencialmente expressos (DEGs) identificados e classificados de acordo com o enriquecimento da ontologia gênica. A análise fisiológica da condutância estomática confirmou respostas ao estresse hídrico no genótipo tolerante 14 dias após a retirada da água. De 34.317 transcritos de genes mapeados para modelos de genes no genoma de referência de Musa, um total de 5.090 DEGs foram identificados em todos os tratamentos. Destes, 573 genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados em bibliotecas infectadas com nematoide em relação ao controle não inoculado. A análise de enriquecimento revelou termos GO superrepresentados relacionados à atividade catalítica, atividade oxidorredutase, ligação a carboidratos e ligação a ácidos nucleicos. Um total de 2.834 DEGs potencialmente envolvidos em estresse hídrico foram identificados, com termos GO super-representados compreendendo resposta ao estímulo, atividade catalítica e ligação a ácidos nucleicos. Para o estresse cruzado, foram identificados 1.683 DEGs responsivos, dentro das categorias de GO enriquecidas de resposta a estímulo, atividade catalítica, atividade de oxidorredutase e ligação a ácidos nucleicos. Por outro lado, a partir de análises de bioinformática de transcritoma obtido de raízes de tomateiro infectado por M. incognita, 20 sequências gênicas foram selecionadas e tiveram a expressão validada via RT-qPCR. Destes, 6 genes foram selecionados e vetores de RNAi host delivered foram desenhados utilizando-se de parte de suas sequências. Os vetores foram inseridos em explantes de tabaco via agroinfiltração, e eventos transgênicos obtidos na geração T1, foram confrontados em bioensaio de inoculação com juvenis J2 de M. incognita, avaliados 60 dias após inoculação. Apenas um de três eventos transgênicos pertencentes à construção gênica 21700 obteve diferença significativa para fator de reprodução, número de ovos por grama de raiz e peso de raiz, quando comparado ao controle não transformado. A análise do transcritoma radicular do genótipo G-075 tolerante ao estresse hídrico, fornece uma maior compreensão da complexa regulação das respostas do hospedeiro que ocorrem durante o estresse hídrico, o estresse biótico e durante os estresses combinados. Os genes candidatos são apropriados para o desenvolvimento de estratégias de manejo de amplo espectro para esses múltiplos estresses com base no melhoramento genético de cultivares superiores. Ademais, identificar genes relevantes ao parasitismo do nematoide, principalmente na fase inicial da infecção, permite o uso de tecnologias como a interferência do RNA visando a obtenção de plantas tolerantes a uma ou mais espécies de fitonematoides.

Frutos não convencionais à agricultura brasileira, como Syzygium jambos (Myrtaceae) são amplamente estudados para uso medicinal, mas as doenças que deterioram esses frutos são negligenciadas. Os gêneros de fungos das famílias Nectriaceae, Bionectriaceae e Botryosphaeriaceae causam doenças importantes em plantas de importância agrícola e florestal, mas raramente são relatados em espécies nativas e/ou causando podridão de frutos. A identificação desses fungos é desafiadora, especialmente o grupo Calonectria-like (Nectriaceae) por englobar fungos relacionados filogeneticamente e morfologicamente ao gênero Calonectria. Desde 1995, a submissão de sequências de diferentes regiões genômicas foi consolidado no GenBank para o reconhecimento das espécies filogenéticas. Essa regra facilitou a identificação de espécies, mas a falta de uniformidade e o número crescente de dados dificulta ou impossibilita os estudos de gama de hospedeiros e distribuição geográfica. Portanto, esse estudo teve o objetivo de realizar uma meta-análise das informações disponíveis no GenBank para os fungos do complexo Calonectria-like e identificar morfo-molecularmente os isolados de Calonectria-like, Clonostachys, Cylindrocladiella, Gliocephalotrichum, Gliocladiopsis e Neofusicoccum obtidos a partir de frutos coletados no Distrito Federal, Goiás, Minas Gerais, Paraná, Pernambuco, Santa Catarina e São Paulo. A meta-análise revelou divergências entre as regiões genômicas depositadas para cada isolado, sendo que as sequências da região fator de elongação (n=5.125) e beta-tubulina (n=5.287) são mais representativas em relação a calmodulina, histona, RNA Polimerase 2, espaçador interno transcrito, e a subunidade maior do ribossomo (28S rDNA). O intercâmbio de amostras entre os grupos de pesquisa proporcionou o “Efeito Matryoshka” evidenciado pela super-representação de isolados. A análise revela que 78,3% das sequências analisadas possuem informações sobre o local de coleta enquanto apenas 12% possuem informações sobre o substrato/hospedeiro. Enquanto a maioria dos gêneros possuem uma distribuição geográfica abrangente, os gêneros Curvicladiella e Xenocylindrocladium são restritos à América do Sul e Ásia, respectivamente, sendo que a maioria das espécies são encontradas no Brasil (90%) e na China (100%), respectivamente. Os 86 isolados identificados morfo-molecularmente pertencem aos gêneros Calonectria (n=15), Clonostachys (n=8), Cylindrocladiella (n=28), Gliocladiopsis (n=18), Gliocephalotrichum (n=2) e Neofusicoccum (n=15). Desse total, sete espécies conhecidas foram documentadas enquanto uma, duas e três espécies novas serão propostas para os gêneros Clonostachys, Calonectria e Cylindrocladiella, respectivamente. As espécies Cylindrocladiella vitis, Gliocladiopsis hennebertii e Neofusicoccum occulatum e N. umdonicola são relatadas pela primeira vez no Brasil enquanto novas combinações de hospedeiras foram registradas para C. pseudocholeuca, C. rogersoniana, Cy. infestans, Cy. lageniformis, Cy. peruviana, Gliocephalotrichum simplex, Gliocladiopsis tenuis, N. batangarum, e N. parvum em frutos de Dypsis madagascariensis, Eugenia aggregata, Eugenia involucrata, Euterpe edulis, Spondias mombin, Syzygium jambos e Terminalia catappa. Esse estudo demonstra a necessidade de levantamentos abrangentes sobre a diversidade de espécies fúngicas em plantas nativas e alerta sobre o risco de transmissão para as plantas de interesse econômico.

A fotossíntese, a condutância estomática e a transpiração são atividades fisiológicas de plantas que influenciam no potencial produtivo das culturas. A interferência dos nematoides das galhas na fisiologia da planta ainda é pouco estudada, assim como a capacidade de rizobactérias amenizar os danos fisiológicos na planta causados por nematoides. A ausência de métodos de controle alternativos ao nematoide Meloidogyne enterolobii dificultam o manejo eficiente e sustentável ao meio ambiente. Os objetivos desta pesquisa foram avaliar in vitro o efeito de um bionematicida, de ingrediente ativo Bacillus methylotrophicus sobre os ovos e juvenis de M. enterolobii e monitorar ao longo do tempo alterações na fisiologia de goiabeira inoculadas com M. enterolobii e tratadas com o bionematicida. Foram realizados experimentos in vitro sobre ovos e juvenis de M. enterolobii. Os tratamentos foram representados pelas concentrações de 1%, 10%, 25%, 50% e 70% do bionematicida, tendo o tratamento com água como controle. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado com seis repetições e duas repetições no tempo. Os tratamentos com ovos foram avaliados aos 2, 4, 6, 8 e 10 dias após a incubação, através da contagem do número de ovos danificados. Os tratamentos com juvenis foram avaliados em intervalos de 24 até 96 horas pela contagem do número de juvenis mortos. O monitoramento da atividade fisiologia da goiabeira foi avaliado em casa de vegetação e em campo e os tratamentos representados por: 1) goiabeira `Pedro Sato´ não inoculada e não tratada com B. met (controle); 2) goiabeira `Paluma´ não inoculada e não tratada com B. met (controle); 3) `Pedro Sato´ não inoculada e tratada com B. met; 4) `Paluma´ não inoculada e tratada com B. met; 5) `Paluma´ inoculada e não tratada com B. met; 6) `Pedro Sato´ inoculada e não tratada com B. met; 7) `Pedro Sato´ inoculada e tratada com B. met e 8) `Paluma´ inoculada e tratada com B.met. Os tratamentos foram dispostos em DIC e DBC, em casa de vegetação e no campo, respectivamente. Foram realizadas quatro aplicações do bionematicida, nas dosagens de 3 mL/L de água por planta em casa de vegetação e 1 mL/L de água por planta no campo. Entre a segunda e a terceira aplicação as plantas foram inoculadas com 5000 ovos e eventuais juvenis de M. enterolobii em casa de vegetação e 6000 ovos e eventuais juvenis de M. enterolobii no campo. Em casa de vegetação foram realizadas sete avaliações dos parâmetros fisiológicos das goiabeiras (condutância estomática, eficiência no uso da água, fotossíntese e transpiração) e seis avaliações do teor de clorofila total ao longo do ciclo de desenvolvimento da goiabeira. Aos 132 dias após a inoculação (DAI) as raízes foram pesadas e determinado o índice de galhas, índice de massas de ovos e o fator de reprodução. Em campo, foram realizadas 10 avaliações dos parâmetros fisiológicos das goiabeiras (condutância estomática, eficiência no uso da água, eficiência de carboxilação, fotossíntese e transpiração) e foi estimada a produtividade através da colheita e posterior pesagem dos frutos. In vitro os danos aos ovos foram crescentes para todos os tratamentos, não havendo diferença entre as dosagens após seis dias de exposição. A mortalidade de J2 aumentou até as 48 horas nas dosagens mais baixas (1%, 10% e 25%), tendo permanecido próxima dos 100% nas dosagens mais altas (50% e 70%), e não houve diferença entre as dosagens após 48 horas de exposição. Em casa de vegetação, as alterações nos parâmetros fisiológicos concentraram-se nos primeiros 44 DAI. Meloidogyne enterolobii e B. met combinados reduziram a condutância estomática e a transpiração aos 26 e 44 DAI, respectivamente. A fotossíntese foi menor aos 26 DAI nos tratamentos que receberam o nematoide e a bactéria em combinação. Meloidogyne enterolobii e B. met isolados e combinados apresentaram redução na eficiência no uso da água aos 26 e 44 DAI. Índice de galhas, índice de massas de ovos e fator de reprodução foram maiores nos tratamentos que receberam o nematoide. No campo, para todos os tratamentos não houve diferença ao longo do tempo para as variáveis fisiológicas e não houve padrão nas alterações ocasionados por M. enterolobii e B.met isolados e combinados. Meloidogyne enterolobii reduziu a condutância estomática em oito avaliações, a eficiência no uso da água e a fotossíntese em três avaliações e a transpiração em sete avaliações. O único aumento condicionado pelo nematoide foi observado na eficiência no uso da água aos 369 DAI. Bacillus methylotrophicus reduziu a fotossíntese aos 421 DAI, porém aumentou a fotossíntese aos 527 DAI, aos 318 e 369 DAI houve aumento na eficiência no uso da água. Meloidogyne enterolobii e B. met combinados reduziram a condutância estomática em 8 avaliações e a transpiração em 4 avaliações. Na eficiência de uso da água e na fotossíntese foi observada redução aos 421 DAI. Meloidogyne enterolobii e B. met combinados aumentaram a eficiência de uso da água aos 369 DAI a eficiência de carboxilação aos 224 e 465 DAI. A aplicação de B. met não atenuou os efeitos negativos de M. enterolobii sobre a atividade fisiológica da goiabeira e M. enterolobii e B. met isolados e combinados não alteraram a produtividade das goiabeiras. Bacillus methylotrophicus provocou danos aos ovos e causou a mortalidade dos J2 de M. enterolobii. Em condições controladas M. enterolobii e B. met combinados reduziram a condutância estomática, eficiência no uso da água, fotossíntese e transpiração das goiabeiras durante a fase inicial do desenvolvimento da frutífera. Meloidogyne enterolobii e B. met isolados reduziram a eficiência no uso da água aos 26 e 44 DAI. Os parâmetros nematológicos não foram influenciados pela bactéria. Em campo, é possivel que a ausência de alterações seja decorrente da influência de fatores ambientais, densidade de inóculos, modo de aplicação da bactéria e combinações das aplicações do nematoide e bactéria no tempo. Houve predomínio de redução nos parâmetros fisiológicos ocasionados pelo nematoide. A aplicação de B. met não atenuou os efeitos negativos do nematoide sobre a atividade fisiológica da goiabeira. Meloidogyne enterolobii e B. met isolados e combinados não alteraram a produtividade das goiabeiras.

A cebola (Allium cepa L.) é uma importante hortaliça cultivada desde a antiguidade e distribuída mundialmente. É a terceira hortaliça mais cultivada, atrás somente da batata e do tomate. Desde 2018 houve um aumento na ocorrência de queima bacteriana em campos de cultivo de cebola nos estados de Goiás, Minas Gerais e Distrito Federal, ameaçando a qualidade e a produtividade da cebola no cerrado brasileiro. Foram coletadas amostras e os isolados bacterianos identificados como sendo Xanthomonas euvesicatoria pv. allii (Xea). Visando ampliar os conhecimentos sobre o patógeno, o objetivo desse trabalho foi estruturar uma nova coleção de isolados, identificar, caracterizar e desenvolver um novo protocolo de detecção por PCR para Xea. A coleção de isolados de 2021 teve seu gênero confirmado pelos primers XgumD F7/R7 e variabilidade pela técnica de marcador molecular BOX-PCR. Haplótipos foram selecionados para o sequenciamento de quatro regiões genômicas para análise de Multilocus sequence analysis (MLSA). Para o desenvolvimento de um protocolo de detecção, os seis genomas disponíveis no GenBank de Xea foram reanotados e então por genômica comparativa buscou-se genes presentes entre todos os isolados e ausentes para demais espécies e patovares. Para o desenho de primers, as sequências dos genes exclusivos foram usadas no software NEB LAMP Primer Design Tool. Os primers sintetizados foram avaliados quanto sua capacidade de amplificação dos isolados de Xea, sensibilidade e especificidade com microbiota isolada de folha de cebola. Todos os isolados foram identificados como sendo do gênero Xanthomonas e pelo BOX-PCR foi possível identificar a presença de quatro haplótipos além dos seis haplótipos da coleção original. Pela análise de MLSA foi visto o agrupamento dos novos isolados com os originais de 2018/2019, com elevados valores de probabilidade posterior, enquanto somente o isolado A-2021-01 agrupou em um clado mais distante com isolados da patovar alfalfae. Somente o par de primer 5038_ID9 foi capaz de amplificar todos os haplótipos somente com o fragmento esperado de 200 pb e sensibilidade de amplificação de concentrações superiores à 50 pg. Nenhum dos isolados de microbiota foi amplificado com este par de primer.

Meloidogyne enterolobii é uma espécie de nematoide emergente no Brasil. Esta espécie tem sido considerada uma das mais agressivas entre os nematoides-das-galhas e vem causando danos às hortaliças e outras culturas de importância econômica, inclusive na presença de resistência genética a outras espécies desse gênero. A resistência genética em plantas, sempre que disponível, é a forma mais eficiente e econômica de controle dos nematoides‑das‑galhas. Nesse sentido, a busca por fontes de resistência é de grande importância para o controle desse nematoide. Culturas de importância econômica, incluindo as leguminosas (pulses) ervilha (Pisum sativum L.), grão-de-bico (Cicer arietinum L.) e lentilha (Lens culinaris Medik.), além de hortaliças como pimenta (Capsicum spp.) e batata-doce (Ipomoea batatas (L.) Lam.), são drasticamente afetadas por Meloidogyne spp. Avaliou-se a reação a M. enterolobii em 14 genótipos de ervilha, 06 de grão-de-bico, 1 de lentilha, 27 de pimenta (Capsicum chinense), 07 de pimentão (C. annuum) e 08 de batata-doce. Todos os experimentos foram conduzidos em casa-devegetação, em delineamento inteiramente casualizado com 06 repetições e cada planta sendo inoculada com 5000 ovos e eventuais juvenis de segundo estádio (J2). Para reação de genótipos de pulses e de batata-doce a M. enterolobii, os experimentos foram repetidos duas vezes no tempo. Quanto à reação de pimentas, foram instalados dois experimentos, um para C. chinense e outro para C. annuum. Sessenta e cinco dias após a inoculação (DAI) das culturas de ervilha, grão-de-bico, lentilha e pimentas e aos 90 DAI para a batata-doce. Foram avaliadas as seguintes variáveis nematológicas: índice de galhas (IG), índice de massa de ovos (IMO), número de ovos por grama de raiz (NOGR) e fator de reprodução (FR). Nenhum dos genótipos de ervilha, grão-de-bico, lentilha e pimentas avaliados apresentaram resistência a M. enterolobii. Entretanto, 03 genótipos de batata-doce (BGBD 1399, MD 1609024 e MD 1610036) foram classificados como resistentes. Diante da importância e das perspectivas de expansão dessas culturas no Brasil, os resultados deste estudo contribuem significativamente para o conhecimento da sua reação de genótipos dessas culturas a essa espécie de nematoide, assim como identificam potenciais fontes de resistência para programas de melhoramento visando o desenvolvimento de cultivares e atendendo à necessidade contínua de pesquisas para seleção de genótipos com resistência a M. enterolobii.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.), espécie pertencente à família Poaceae, é a principal fonte de matéria-prima para a produção de açúcar e etanol combustível no Brasil, razão pela qual ocupa papel de destaque na economia do país. A cultura é acometida pela doença podridão abacaxi, causada por Thielaviopsis sp., fungo este que prejudica, principalmente, a brotação das gemas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar in vitro e in vivo a eficiência de, inicialmente 15 linhagens de Trichoderma no controle dessa doença, além de uma linhagem comercial incluída como referência nos ensaios. Adotaram-se diferentes métodos de laboratório, como pareamento de culturas, exposição aos compostos orgânicos voláteis (COVs) em atmosfera compartilhada e exposição aos extratos brutos autoclavados do antagonista. Todas as linhagens de Trichoderma foram capazes de inibir o crescimento micelial de Thielaviopsis sp. Os demais ensaios realizados seguiram com as linhagens que apresentaram melhores desempenhos, sendo elas CEN281 (T. afroharzianum), CEN1277 (T. asperelloides), CEN1513 (T. koningiopsis), CEN1546 (T. afroharzianum) e CEN219 (T. harzianum) sendo essa a linhagem comercial. Abordouse também a inibição do crescimento micelial após a exposição aos COVs na cronologia, por ser este um dos principais mecanismos de ação dos fungos antagonistas. Os experimentos in vivo consistiram na inoculação do patógeno e antagonistas em toletes de cana “CTC20”. Verificou-se a redução da severidade da doença pelas linhagens de Trichoderma tanto em ensaios de laboratório, como em ensaios em casa de vegetação. Nestes últimos, avaliaram-se a altura de plantas, massa seca de raízes e parte aérea, diâmetro do colmo, além da severidade da doença. O principal momento de inibição do patógeno ocorreu após as 72 horas de crescimento do antagonista, para a maioria das linhagens no ensaio de COVs na cronologia. A severidade da doença foi reduzida em aproximadamente 70% por uma das linhagens selecionadas. Os ensaios conduzidos em casa de vegetação complementaram os anteriores, conduzidos in vitro e in vivo, comprovando a eficácia das linhagens estudadas no controle da podridão abacaxi em cana-de-açúcar. Infere-se, com base nos testes realizados, que o agente biocontrole pode ser utilizado, em tratamento dos toletes previamente ao plantio, como uma medida profilática para o controle da podridão abacaxi e, também, como um promotor de enraizamento para a cultura, inclusive na produção de mudas pré-brotadas (MPB). Em todos os ensaios realizados, uma linhagem da Coleção da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, identificada como pertencente à espécie T. asperelloides (CEN1277) apresentou destaque nos ensaios conduzidos, com resultados semelhante aos verificados com a linhagem comercial já registrada para controle da doença. Portanto, essa linhagem pode ser disponibilizada para o desenvolvimento de um novo produto, conforme demanda o mercado de fungicidas biológicos.