Banca de DEFESA: PRISCILA RAYANE DE MENEZES SILVA MACHADO

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : PRISCILA RAYANE DE MENEZES SILVA MACHADO
DATA : 26/11/2024
HORA: 08:30
LOCAL: Plataforma Teams
TÍTULO:

"Desenvolvimento de protocolos de detecção de vírus patógenos de milho (Zea mays L.) por RTPCR e RT-qPCR a partir da análise de viroma por HTS."

PALAVRAS-CHAVES:

milho; SCMV; MaYMV; MSMV; MRFV; umbravirus-like; RT-qPCR; SYBR Green.

PÁGINAS: 62
RESUMO:

O milho (Zea mays L.) é uma das culturas de grãos mais importantes no mundo, com demanda crescente para alimentação, ração animal, matéria-prima para indústria e produção de etanol (Lappe et al. 2022). O Brasil ocupa a terceira posição entre os maiores produtores de milho, respondendo por 10% da produção global, contudo, sua produtividade (5.495 kg/ha) é significativamente menor quando comparada à produtividade dos EUA (12.344 Kg/ha) (Conab, 2024; USDA, 2024). A baixa eficiência de manejo de pragas e doenças, que causam cerca de 23% de perdas de produtividade mundial, pode ser um dos fatores responsáveis por essa baixa produtividade. No Brasil, até o momento, há o relato de dez espécies de vírus infectando milho (Mar et. al., 2013, Fontenele et al., 2018; Kitajima, 2020). No entanto, apenas cinco dessas espécies têm suas sequências genômicas confirmadas. São elas: maize rayado fino virus - MRFV, gênero Marafivirus (Hammond e Bedendo, 2007), sugarcane mosaic virus – SCMV, gênero Potyvirus (Gonçalves et al., 2011), barley yellow dwarf virus PAV – BYDV-PAV, gênero Luteovirus (Mar et. al., 2013), maize yellow mosaic virus – MaYMV, gênero Polerovirus (Gonçalves et al., 2017; 2020) e maize striate mosaic virus – MSMV, gênero Mastrevirus (Fontenele et al., 2018). Apesar da importância econômica do milho, no Brasil, há uma lacuna nos estudos sobre os vírus que afetam essa cultura (levantamentos de incidência e ocorrência), principalmente devido à falta de métodos padronizados para detecção e identificação dos vírus. Nesse contexto, o presente estudo propõe desenvolver protocolos de detecção para os vírus de milho por RT-PCR e RT-qPCR baseado em SYBR Green, utilizando a base de dados das sequências virais obtidas por high-throughput sequencing (HTS) a fim de garantir a compatibilidade de primers com os isolados circulantes. Amostras de milho de quatro regiões do Brasil foram analisadas por HTS a fim de conhecer a diversidade viral presente na cultura, inclusive potenciais novos vírus ou variantes. A partir desses dados, primers para RT-PCR e RT-qPCR foram desenhados com base nas regiões mais conservadas e controles positivos construídos em plasmídeos pGEM-T Easy e pCR4-TOPO. O resultado do HTS apontou a presença de cinco vírus, dos quais quatro são conhecidos no Brasil (MRFV, SCMV, MaYMV e MSMV) e um trata-se do primeiro relato, um umbravirus-like. Todos foram confirmados por RT-PCR nas amostras individuais de milho. Os primers de RT-qPCR foram testados in silico quanto a especificidade, temperatura de desnaturação e probabilidade de “self-dimer” e “hetero-dimer”. Após confirmação das sequências dos controles positivos por método Sanger, curvas-padrão de RT-qPCR para cada alvo viral foram elaboradas utilizando cinco diluições seriadas, em triplicata, e o número de cópias calculado. O ensaio de RT-qPCR baseado em SYBR Green foi desenvolvido com amostras de campo em triplicata. A análise da curva de dissociação permitiu discriminar os resultados positivos de eventuais amplificações não específicas, pois os amplicons de cada alvo apresentaram temperatura de melting consistente. A especificidade dos primers também foi confirmada pela visualização de bandas nos tamanhos esperados em gel de agarose. A avaliação das amostras juntamente com o uso de controles negativos e controle interno (gene de referência) permitiu a detecção precisa dos alvos. Assim, os protocolos desenvolvidos podem ser usados para detecção dos patógenos (aplicação qualitativa), em estudos de levantamento e incidência dessas viroses, podendo posteriormente ser testados para fins de quantificação de carga viral.

MEMBROS DA BANCA:
Externo à Instituição - ERICH YUKIO TEMPEL NAKASU - EMBRAPA
Interno - 3051226 - MAURICIO ROSSATO
Externo à Instituição - RENATO DE OLIVEIRA RESENDE - OUTROS
Interno - 1623558 - TATSUYA NAGATA