Banca de DEFESA: Isabella Cristina Santos do Egito

Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : Isabella Cristina Santos do Egito
DATA : 27/06/2023
HORA: 08:00
LOCAL: Meio virtual
TÍTULO:

" LAMP colorimétrico específico para a detecção do enfezamento vermelho do milho usando uma região genômica exclusiva.

PALAVRAS-CHAVES:

Diagnose, Fitoplasma, loop-mediated isothermal amplification.

PÁGINAS: 45
RESUMO:

O Brasil se destaca por ser o terceiro maior produtor de milho no mundo, além de possuir autossuficiência no abastecimento nacional. Mesmo com a alta produção, o país possui em toda a sua extensão, condições climáticas que favorecem o ataque de diversos patógenos ao milho. O enfezamento vermelho do milho, causado pelo fitoplasma (Maize bushy stunt phytoplasma), é uma das doenças mais prejudiciais à cultura. Diante da importância do patógeno, existe a demanda por métodos de detecção que sejam rápidos e acurados. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um desses métodos, sendo célere, sensível, com alta especificidade e podendo ser utilizada em análises a campo. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um protocolo de LAMP, através de genômica comparativa, para Maize bushy stunt phytoplasma (MBSP) em milho. Para desenho dos conjuntos de primers foi utilizada a sequência do genoma completo do MBSP e demais sequencias de outros patógenos no software RUCS. Foi possível identificar 3706 sequencias core únicas, dessas, as 60 mais adequadasforam usadas para o desenho (NEB LAMP primer design) e síntese de três conjuntos de primers que apresentavam os criterios desejados. Uma coleção de 52 amostras de milho com e sem sintomas foram coletadas, três dessas tiveram a região do 16S rRNA amplificadas, sequenciadas e confirmadas para a presença do MBSP através de análise filogenética. Para o teste do ensaio LAMP, o conjunto de primers mais promissor 0_731_10_ID1, juntamente com o Kit Warmstart colorimetric LAMP 2X master mix (NEB) e as amostras positivas para MBSP foram usados para avaliação das melhores condições de reação. A proporção de primers internos e externos 1:4 e temperatura de 65 °C foram consideradas as mais adequadas para a reação e empregadas aos demais testes. A coleção de amostras foi testada com o Nested-PCR com os primers P1/Tint e R16mF2/R16mR2 e comparada com o ensaio LAMP do presente trabalho. Considerando a presença e ausência de sintomas, ocorreu a confirmação de que as sintomáticas eram positivas para o LAMP em maior proporção que para o Nested -PCR. A sensibilidade do ensaio foi avaliada usando o produto de PCR com os primers externos F3/B3 purificado, quantificado e diluído de forma seriada em 10 concentrações. O ensaio LAMP proposto se mostrou sensível detectando até 0,1 fg µL-1 de DNA. Para avaliar o potencial do ensaio com amostras vegetais, sem extração prévia de DNA, discos de folhas das amostras foram maceradas e testadas diretamente na reação LAMP, resultando em positivo para as sintomáticas e negativo para assintomáticas. Esse resultado não só confirma que a reação resistiu à possíveis inibidores no tecido vegetal como também não teve reação cruzada com a microbiota foliar das amostras.

MEMBROS DA BANCA:
Externa à Instituição - Adriane Wendland Ferreira - EMBRAPA
Externa à Instituição - ANGELA MEHTA DOS REIS - EMBRAPA
Interna - 2215041 - MARISA A DA S VELLOSO FERREIRA
Presidente - 3051226 - MAURICIO ROSSATO